Integrierte genomische Sequenzierung bei chronischer myeloischer Leukämie (MBC).
Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 12816 (2022) Diesen Artikel zitieren
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Chronische myeloische Leukämie (CML) ist ein Modell der Leukämogenese, bei dem die genauen molekularen Mechanismen, die der Blastenkrise zugrunde liegen, noch unerforscht sind. Die aktuelle Studie identifizierte mithilfe integrierter Genomsequenzierung mehrere häufige und seltene wichtige Befunde bei myeloischer Blastenkrise CML (MBC-CML) und deckte alle Klassen von Genen ab, die am Leukämogenese-Modell beteiligt sind. An den peripheren Blutproben von drei CML-Patienten in der myeloischen Explosionskrise wurde eine integrierte Genomsequenzierung mittels Whole Exome Sequencing (WES), Chromosomensequenzierung und RNA-Sequenzierung durchgeführt. Zur Bewertung wichtiger Varianten krebsrelevanter Gene wurde eine interne Filterpipeline eingesetzt. Für die Interpretation potenziell wichtiger Ergebnisse (PIFs) und potenziell umsetzbarer Ergebnisse (PAFs) wurden Standard-Varianten-Interpretationsrichtlinien verwendet. Einzelnukleotidvariation (SNV) und kleine InDel-Analyse durch WES entdeckten sechzehn PIFs, die alle fünf bekannten Klassen leukämogener Gene bei myeloischen Malignomen beeinflussen, einschließlich Signalwegkomponenten (ABL1, PIK3CB, PTPN11), Transkriptionsfaktoren (GATA2, PHF6, IKZF1, WT1), epigenetische Regulatoren (ASXL1), Tumorsuppressor- und DNA-Reparaturgene (BRCA2, ATM, CHEK2) und Komponenten des Spleißosoms (PRPF8). Diese Varianten beeinflussen Gene, die an der Proliferation, Selbsterneuerung und Differenzierung von Leukämie-Stammzellen beteiligt sind. Beide Patienten Nr. 1 und Nr. 2 hatten umsetzbare bekannte Missense-Varianten auf ABL1 (p.Y272H, p.F359V) und Frameshift-Varianten auf ASXL1 (p.A627Gfs*8, p.G646Wfs*12). Die Varianten GATA2-L359S bei Patient Nr. 1, PTPN11-G503V und IKZF1-R208Q bei Patient Nr. 3 waren ebenfalls PAFs. Zur Bestätigung aller identifizierten Varianten wurde RNA-Sequenzierung verwendet. Bei Patient Nr. 3 ergab die Chromosomensequenzierung mehrere pathogene Deletionen im kurzen und langen Arm von Chromosom 7, die mindestens drei kritische leukämogene Gene (IKZF1, EZH2 und CUX1) betrafen. Die große Deletion, die am kurzen Arm von Chromosom 17 bei Patient Nr. 2 entdeckt wurde, führte auch zur Deletion des TP53-Gens. Durch die integrierte Genomsequenzierung in Kombination mit der RNA-Sequenzierung kann ein breites Spektrum an Varianten, von SNVs bis hin zu CNVs, erfolgreich entdeckt und bestätigt werden. Diese Strategie kann eine wirksame Methode sein, um umsetzbare Erkenntnisse zu ermitteln und die pathophysiologischen Mechanismen zu verstehen, die MBC-CML zugrunde liegen, und um weitere Einblicke in die genetischen Grundlagen von MBC-CML und deren zukünftige Behandlung zu gewinnen.
Chronische myeloische Leukämie (CML) ist ein einzigartiges Modell für die Entstehung von Krebs und wird aufgrund klinischer und pathologischer Merkmale als dreiphasiges myeloproliferatives Neoplasma klassifiziert. Prämaligne Leukämie-Stammzellen (LSCs) werden tatsächlich im Knochenmark durch unbekannte Mutageneseprozesse erzeugt1,2. In diesem Schritt kann es sein, dass die Krankheit ein Jahrzehnt oder länger nicht nachweisbar ist. Weitere onkogene Prozesse führen dazu, dass sich LSCs zu Leukämie-Vorläuferzellen (LPCs) entwickeln3. Leukämogene Veränderungen betreffen hauptsächlich fünf Klassen regulatorischer Proteine: Signalwegkomponenten, Transkriptionsfaktoren (TFs), epigenetische Regulatoren (ERs), Tumorsuppressorgene (TSGs) und Komponenten des Spleißosoms4.
Ohne therapeutische Interventionen oder im Falle einer Arzneimittelresistenz schreitet die CML in die akzelerierte Phase (AP) und dann in eine akute Leukämiephase fort, die als Blastenphase oder Blastenkrise bezeichnet wird5. Selbst mit der Einführung der Tyrosinkinase-Inhibitor-Therapie beträgt die Überlebenszeit in der Blastenphase weniger als 12 Monate. Im Allgemeinen ist die Explosionskrise bei chronischer myeloischer Leukämie immer noch eine tödliche Krankheit6,7.
Im Laufe des letzten Jahrzehnts wurde mithilfe von Massively Parallel Sequencing (MPS) oder Next Generation Sequencing (NGS) eine mehrdimensionale genomische Sichtweise mit höherer Auflösung der molekularen Profilierung möglich8. Es wurde gezeigt, dass die Kombination von Exom-, Genom- und RNA-Sequenzierungsdaten9, die als integrative Sequenzierung10,11,12 bezeichnet wird, den Weg für ein besseres Verständnis der Mechanismen und Pathogenese des Krebses ebnet und möglicherweise das klinische Management und die Suche nach neuen therapeutischen Zielen insbesondere in der Krebserkrankung verbessern kann Patienten im fortgeschrittenen Stadium13.
In der vorliegenden Studie führten wir eine integrierte Genomsequenzierung durch einen internen Filteralgorithmus durch, um die wichtigen/umsetzbaren Erkenntnisse zur Leukämogenese aufzudecken und das myeloische Leukämogenesemodell bei drei iranischen CML-Patienten mit myeloischer Explosionskrise zu untersuchen.
Drei Patienten (aus drei nicht verwandten Familien) mit der klinischen Diagnose einer CML in der Blastenphase wurden aus dem Shariati-Krankenhaus in Teheran, Iran, rekrutiert. Die Einschlusskriterien basierten auf klinischen Präsentationen und hämatologischen Befunden im peripheren Blut und Knochenmark gemäß der WHO-Leitlinie 201614.
Die Studie wurde von der Ethikkommission der Iranischen Universität für Medizinische Wissenschaften genehmigt (Code: IR.IUMS.REC 1395.95-04-87-30235). Alle Probanden und/oder ihre Erziehungsberechtigten gaben ihr Einverständnis zur Teilnahme. Alle Methoden, einschließlich der Einholung der Einwilligung nach Aufklärung, wurden in Übereinstimmung mit den oben genannten ethischen Standards und Richtlinien durchgeführt.
Die vollständige Exomsequenzierung (WES) wurde zusammen mit der Chromosomensequenzierung und der RNA-Sequenzierung an extrahierter DNA und RNA aus peripheren Blutproben in der Explosionskrisenphase durchgeführt.
Periphere Blutproben von Patienten wurden in EDTA-haltigen Röhrchen gesammelt und zur Extraktion genomischer DNA mit dem Blood SV-Mini-Kit (GeneAll Biotechnology Co., LTD, Südkorea) gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet. Die extrahierten genomischen DNA-Proben wurden einer WES mit dem Agilent SureSelect V6-post Capture/Target Enrichment Kit unterzogen. Für den dritten Patienten wurde das TWIST Human Core Exome Kit (Twist Bioscience, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet. Die angereicherten Bibliotheken wurden auf Illumina-Plattformen (Illumina Inc., CA, USA) sequenziert. Tabelle S1 zeigt einen zusammenfassenden Bericht der Datenanalysemetriken aus dem WES der Patienten.
Paired-End-Sequenzablesungen wurden durch BWA-MEM auf das menschliche Referenzgenom refseq (NCBI) (GRCh38-Assembly) abgebildet. Picard-Software wurde verwendet, um doppelte Lesevorgänge zu markieren. Das Genome Analysis Tool Kit (GATK)-Softwarepaket Mutect2 wurde zum Aufrufen einzelner Nukleotidvarianten (SNVs) und kurzer Insertionen oder Deletionen (Indels) verwendet. Die intronischen Varianten wurden entfernt, die 100 bp, die jedes Exon flankieren, wurden jedoch mithilfe der Intervall-/Bettdatei in VCF-Dateien aufgenommen.
Zur Kommentierung und Interpretation von Varianten wurden mehrere Tools verwendet, darunter CGI, Varsome, InterVar, CancerVar und Franklin. Die mit Anmerkungen versehenen VCF-Dateien wurden gefiltert, um Tier1- oder Tier2-Varianten gemäß der AMP-Klassifizierung sowie pathogene (P), wahrscheinlich pathogene (LP) oder anfällige pathogene Varianten basierend auf der ACMG-Klassifizierung zu finden.
Alle Tier-1- oder Tier-2-Varianten in der AMP-Klassifizierung und die Tier-3-Varianten, die in der ACMG-Klassifizierung pathogen (P), wahrscheinlich pathogen (LP) oder tendenziell pathogenes VUS waren, wurden als potenziell wichtige Befunde (PIFs) ausgewählt. PIFs, von denen bekannt ist, dass sie therapeutische, prognostische oder diagnostische Biomarker sind, wurden als potenziell umsetzbare Ergebnisse (PAFs) gekennzeichnet.
RNA aus Vollblut im PaxGene-Röhrchen wurde mit dem TruSeq Stranded Total RNA with Ribo-Zero Gold Kit (Illumina Inc., CA, USA) unter Verwendung von 1 µg DNAse-behandelter RNA extrahiert und verarbeitet. Anschließend wurde eine Paired-End-Sequenzierung auf Illumina-Plattformen durchgeführt.
CLC Genomics Workbench 20 wurde für die RNA-Sequenzierung und Fusionsgenanalysen verwendet. Die Ergebnisse der RNA-Sequenzierung wurden zur Bestimmung der Ausreißer-Expressionsanalyse von Genen, die wichtige/umsetzbare Varianten beherbergen, zur Analyse der Fusionstranskripte sowie zur Bestätigung der in WES gefundenen Varianten verwendet.
Vista™ Chromosome Sequencing-100 K, eine NGS-basierte Sequenzierung des gesamten Genoms, wurde in BGI Clinical Laboratories durchgeführt, um Variationen der Kopienzahl (≥ 100 Kb) zu bewerten.
Die identifizierten SNVs und kleinen Indels in WES wurden in den Mapping-Lesespuren nach dem Import von WES-BAM-Dateien in die CLC-Genomik-Workbench 20 visuell validiert. Darüber hinaus wurden die Validierungen der identifizierten WES-Varianten mithilfe von RNASeq-BAM-Dateien durchgeführt, indem sowohl Varianten- als auch Genexpression bestätigt wurden .
Die erkannten CNVs in Chromosomensequenzdaten wurden durch CNV-Analyse aus WES-Daten unter Verwendung der CLC Genomics Workbench 20 validiert.
Die Studie wurde von der Ethikkommission der Iranischen Universität für Medizinische Wissenschaften genehmigt (Code: IR.IUMS.REC 1395.95-04-87-30235). Für die Teilnahme wurde von allen Probanden und/oder ihren Erziehungsberechtigten eine Einverständniserklärung eingeholt.
Bei der Patientin (I) handelte es sich um eine 66-jährige Frau, die an Fieber, Hepatosplenomegalie, Leukozytose, Anämie und Thrombozytopenie litt. Der Blastenwert im peripheren Blut betrug 25 %. Knochenmarkpunktion und Immunphänotypisierung bestätigten die myeloische Blastenkrise. Der Patient hatte eine Vorgeschichte von Schilddrüsenkrebs, der viele Jahre vor der Entwicklung von CML behandelt worden war. Sie wurde im Alter von 63 Jahren mit der Primärdiagnose einer CML in der chronischen Phase im Sinne einer Leukozytose mit myeloischen Vorläufern im peripheren Blut und einem positiven Philadelphia-Chromosom im Karyotyp ins Krankenhaus eingeliefert.
Die Patientin (II), eine 55-jährige Frau, litt an Leukozytose, Anämie und Thrombozytopenie. Die Diagnose einer CML in der chronischen Phase wurde 15 Jahre vor der Blastenphase im Alter von 40 Jahren gestellt. Es gab 36 % Blasten im peripheren Blut. Knochenmarkpunktion und Immunphänotypisierung bestätigten die myeloische Blastenkrise. Bei der Explosionskrise zeigte der Karyotyp des peripheren Blutes einen Klon, der sowohl für das Philadelphia-Chromosom als auch für das Isochromosom 17q positiv war, sowie einen Klon mit parazentrischer Inversion in 15q.
Patient (III) war ein 45-jähriger Mann mit Leukozytose, Anämie und Thrombozytopenie. Die Diagnose einer CML in der chronischen Phase wurde zwei Jahre vor der Blastenphase im Alter von 43 Jahren gestellt. Es gab 40 % Blasten im peripheren Blut. Knochenmarkpunktion und Immunphänotypisierung bestätigten die myeloische Blastenkrise.
Das BCR-ABL1-Fusionstranskript (b13-a2) wurde auch in der RNA-seq-Fusionsgenstudie aller Patienten während der Explosionskrisenphase gefunden.
Tabelle 1 fasst die detaillierten klinischen und paraklinischen Befunde der Patienten bei der CML-Diagnose in der chronischen Phase zusammen. Die klinischen und paraklinischen Befunde zur myeloischen Explosionskrise sind in Tabelle 2 dargestellt.
Die WES-Analyse identifizierte 16 PIFs (Abb. 1, 2 und 3), in denen die Varianten ABL1-Y272H, ASXL1-A627Gfs*8, GATA2-L359S, ABL1-F359V, ASXL1-G646Wfs*12, PTPN11-G503V und IKZF1-R208Q klassifiziert wurden als PAFs. Die Varianten ABL1-I418T, PIK3CB-R231H, CHEK2:c.-4C > T, BRCA2-P3292L, ABL1-E459G, PRPF8-G1796R, PHF6-R274Q, WT1-R435X und ATM-C117Y waren potenziell wichtige Krebsvarianten, die es nicht waren umsetzbar (Tabelle 3).
Die Paired-End-Mapping-Lesespur zeigt Lesevorgänge und erkannte Varianten beim ersten Patienten an. Die potenziell wichtigen Erkenntnisse aus der WES-Datenanalyse werden in der CLC Genomics Workbench-Software präsentiert. (A) hg38-Sequenzspur mit WES-zugeordneter Lesespur; (B) hg38-Sequenzspur mit RNA-Seq-kartierter Lesespur; (C) Genexpressionsspur; (D) Gen-, mRNA- und CDS-Spuren; (E) die genomische Koordinate der Variante auf hg38 und der Variantenname. P1: Patient Nr. 1.
Die Paired-End-Mapping-Lesespur zeigt Lesevorgänge und erkannte Varianten beim zweiten Patienten an. Die potenziell wichtigen Erkenntnisse aus der WES-Datenanalyse werden in der CLC Genomics Workbench-Software präsentiert. (A) hg38-Sequenzspur mit WES-zugeordneter Lesespur; (B) hg38-Sequenzspur mit RNA-Seq-kartierter Lesespur; (C) Genexpressionsspur; (D) Gen-, mRNA- und CDS-Spuren; (E) die genomische Koordinate der Variante auf hg38 und der Variantenname. P2: Patient Nr.2.
Die Paired-End-Mapping-Lesespur zeigt Lesevorgänge und erkannte Varianten beim dritten Patienten an. Die potenziell wichtigen Erkenntnisse aus der WES-Datenanalyse werden in der CLC Genomics Workbench-Software präsentiert. (A) hg38-Sequenzspur mit WES-zugeordneter Lesespur; (B) hg38-Sequenzspur mit RNA-Seq-kartierter Lesespur; (C) Genexpressionsspur; (D) Gen-, mRNA- und CDS-Spuren; (E) die genomische Koordinate der Variante auf hg38 und der Variantenname. P3: Patient Nr. 3.
Bei dem Patienten handelte es sich um einen BCR-ABL1-positiven CML-Fall in der Phase der myeloischen Explosionskrise. Sie hatte einen abnormalen Karyotyp mit Philadelphia-Chromosom. In der Chromosomensequenz gab es keine spezifischen Änderungen der Kopienzahl.
In WES hatte sie sechs PIFs, die zu allen Klassen leukämogener Gene beitrugen (Abb. 1), mit Ausnahme der Spleißkomponenten (Klasse V). Die p.Y272H-Variante auf ABL1 (Klasse I), p.A627Gfs*8 auf ASXL1 (Klasse III) und p.L359S auf GATA2 (Klasse II) waren PAFs.
Bei dem Patienten handelte es sich um einen BCR-ABL1-positiven CML-Fall in der Phase der myeloischen Explosionskrise. Sie hatte einen abnormalen komplexen Karyotyp mit Philadelphia-Chromosom und Isochromosom 17q in einem Klon und parazentrischer Inversion in 15q in der anderen Stammlinie (46,XX, t(9;22)(q34;q11.2),i(17)(q10)[ 17] /46,sl,inv(15)(q21,q25)[33]). In der Chromosomensequenz (Abb. S1) gab es Deletionen in 15q und 17p und Duplikationen in 17q (46,XX,del(15q26.3); del(17p11.2p13.3); dup(17p11.2q25.3)) ). Das TP53-Gen ist ein leukämogenes Gen der Klasse II (Transkriptionsfaktor), das sich in 17p13.1 befindet und bei diesem Patienten deletiert ist.
In WES hatte sie sechs PIFs, die zu allen Klassen leukämogener Gene beitragen (Abb. 2). Unter Berücksichtigung der TP53-Beteiligung durch 17p-Deletion weist dieser Patient sieben PIFs auf. Die p.F359V-Variante in ABL1 (Klasse I), p.G646Wfs*12 in ASXL1 (Klasse III) und die TP53-Deletion (Klasse IV) waren PAFs.
Bei dem Patienten handelte es sich um einen BCR-ABL1-positiven myeloischen Blastenkrisen-CML. In der Chromosomenfolge (Abb. S1) hatte er mehrere Deletionen in 7p und 7q (46,XY,del(7p14.3p21.1); del(7p11.2p14.3); del(7q11.23q21.11)). IKZF1 (7p12.2), EZH2 (7q35-q36) und CUX1 (7q22) sind wichtige leukämogene Gene, die in den Deletionsregionen liegen. Das EZH2-Gen ist ein epigenetisches Regulatorgen (H3K27-Methyltransferase; Klasse III) und CUX1 ist ein Transkriptionsfaktor (Klasse II), der TP53 und ATM reguliert.
Er hatte auch vier PIFs in WES (Abb. 3). Im Hinblick auf die pathogenen Deletionen in den kurzen und langen Armen von Chromosom 7, die EZH2 und CUX1 betreffen, weist dieser Patient sechs PIFs auf, an denen vier Klassen leukämogener Gene beteiligt sind. PTPN11:p.G507V (Klasse I) und IKZF1:p.R65Q-Varianten (Klasse II) waren PAFs. Die Varianten WT1:p.R435X (Klasse II) und ATM:p.C117Y (Klasse IV) waren keine PAFs.
Die IKZF1-Variante (p.R65Q) in Kombination mit del(7p11.2p14.3) kann das IKZF1-Genprodukt als wichtigen Transkriptionsfaktor bei myeloischen Malignomen beeinflussen.
Die Fähigkeit, den Prozess der Leukämogenese zu analysieren und zu modellieren, kann bei der wirksamen Behandlung und Behandlung hämatologischer Malignome hilfreich sein. Gemäß dem von Murati et al.4 vorgeschlagenen „Spielautomaten“-Modell der Leukämogenese kann der Übergang von der chronischen Phase zur sekundären akuten myeloischen Leukämie (Blastkrise) durch die Kombination von mindestens vier Schritten modelliert werden, in denen eine Klasse leukämogener Gene betroffen ist in jedem Schritt.
Mithilfe integrierter Genomsequenzierung zur Beurteilung der von SNVs, Indels und CNVs betroffenen Gene waren in der vorliegenden Studie bei allen MBC-CML-Patienten mindestens fünf leukämogene Gene beteiligt. Die in WES nachgewiesenen SNV- und Indel-Varianten repräsentieren alle Klassen leukämogener Gene (Abb. 4), einschließlich des Signalweggens (ABL1-Y272H, ABL1-I418T, ABL1-F359V, ABL1-E459G, PIK3CB-R231H, PTPN11-G503V) und der Transkription Faktoren (GATA2-L359S, PHF6-R274Q, IKZF1-R208Q, WT1-R435X), epigenetische Regulatoren (ASXL1-A627Gfs*8, ASXL1-G646Wfs*12), Tumorsuppressor- und DNA-Reparaturgene (BRCA2-P3292L, ATM-C117Y, CHEK2:c.-4C > T) und Komponenten des Spleißosoms (PRPF8-G1796R).
Die erkannten SNV- und Indel-Varianten in WES stehen im Zusammenhang mit leukämogenen Genklassen. Zu den Klassen leukämogener Gene gehören Signalweggene (Klasse I), Transkriptionsfaktoren (Klasse II), epigenetische Regulatoren (Klasse III), Tumorsuppressor- und DNA-Reparaturgene (Klasse IV) sowie Komponenten des Spleißosoms (Klasse V).
Die erkannten Varianten in verschiedenen Signalweg-bezogenen Genen, einschließlich ABL1, PIK3CB und PTPN11, bei MBC-CML-Patienten können die ErbB-, PI3K-Akt-, Ras-MAPK-Kaskade- und JAK-STAT-Signalwege beeinflussen15,16,17. ABL1 war am ersten und zweiten Patienten beteiligt. In ABL1 wurden vier wichtige Missense-Varianten nachgewiesen (p.Y272H, p.I418T, p.F359V, p.E459G). Alle Varianten befanden sich in der Tyrosinkinasedomäne von ABL1 und wurden zuvor in CML beschrieben (COSM12576, COSM12605, COSM1460549)18. Insbesondere Mutationen in der ABL1-Kinasedomäne wurden bei CML-Patienten in der Blastenphase identifiziert19. Beim Fortschreiten der CML wurde über das Auftreten von zwei oder mehr Mutationen im BCR-ABL1-Fusionsgen nach einer TKI-Therapie berichtet20.
PIK3CB-R231H ist eine wichtige Missense-Variante in der Ras-Bindungsdomäne (RB-Domäne). Über diese schädliche Variante des PIK3CB-Gens wurde bei hämatologischen Malignomen, einschließlich CML, nicht berichtet (https://www.mycancergenome.org/content/gene/pik3cb/). Dieses Gen spielt eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung solider Tumore16,21.
Die PTPN11-G507V-Variante des dritten Patienten befindet sich in der Phosphatase (PH)-Domäne. Obwohl PTPN11-Mutationen in der Blastenphase der CML dokumentiert wurden, ist die p.G507V-Veränderung eine neue Variante der CML und wurde nur bei anderen myeloischen Malignomen wie JMML, AML und MDS identifiziert. (COSM14271).
Bei MBC-CML-Patienten gab es mehrere wichtige Varianten in verschiedenen Transkriptionsfaktor-Genen, darunter GATA2, PHF6, WT1 und IKZF1. Darüber hinaus waren die Gene TP53, IKZF1 und CUX1 von chromosomalen Deletionen/CNVs betroffen. Die GATA2-L359S-Variante des ersten Patienten befindet sich in der Zinkfinger-GATA-Domäne. Es wurde darauf hingewiesen, dass GATA2-Keimbahnmutationen Patienten stark für Leukämie prädisponieren22. GATA2-Mutationen wurden in MBC-CML beschrieben; Die p.L359S-Variante wurde jedoch bisher nicht bei Blasform-CML gemeldet. Die p.L359S-Variante wurde als prädisponierende, wahrscheinlich pathogene Keimbahnvariante bei MDS/AML23 vorgeschlagen.
Die PHF6-R274Q-Variante bei Patient Nr. 2 befindet sich in der PHD-ähnlichen Zinkbindungsdomäne. Mutationen in PHF6 wurden auch in der CML in der Blastenphase gemeldet, während die p.R274Q-Variante eine neuartige Mutation in CML ist, die nur bei akuter lymphoblastischer Leukämie mit frühen T-Zell-Vorläufern (ETP) (COSM306061) auftrat.
Beim dritten Patienten wurde eine biallelische Beteiligung von IKZF1 beobachtet. Die erkannte Missense-Variante befand sich in der C2H2-Zinkfingerdomäne des IKZF1 (p.R65Q). Aufgrund der 7p-Deletion zeigte diese Variante in der WES-Analyse einen hohen Varianten-Allelanteil (VAF = 100 %). IKZF1-Mutationen wurden sowohl in der chronischen als auch in der Blastenphase von CML24 gefunden. Der Patient mit der IKZF1-Mutation hatte auch eine Mutation in PTPN11. Es wurde gezeigt, dass Mutationen in IKZF1 und PTPN11 bei AML-Patienten mit einem aggressiven klinischen Verlauf und einer primären Chemotherapieresistenz verbunden sind25. Bei dem dritten Patienten wurde in den zytogenetischen Studien eine Beteiligung des CUX1-Gens im Hinblick auf eine 7q-Deletion festgestellt. CUX1 ist ein Transkriptionsfaktor, der TP53 und ATM26 reguliert.
Die 17p-Deletion im TP53-Gen wurde durch zytogenetische Analyse beim zweiten Patienten festgestellt. TP53 ist ein Transkriptionsfaktor, der sich in 17p13.1 befindet. TP53 reguliert den Zellzyklus, die DNA-Reparatur und die Apoptose. Es wurde beobachtet, dass 45 % der MPN-Patienten (MPN-BP) in der Blastenphase einen TP53-bedingten Defekt wie TP53-Genmutationen oder Haploinsuffizienz aufweisen27. Die Beteiligung von TP53 wurde sowohl in der chronischen als auch in der Blastenphase von CML28,29 beschrieben.
Beim zweiten und dritten Patienten wurden zusätzliche Chromosomenanomalien (ACAs) entdeckt. Es ist bekannt, dass Patienten mit Hochrisiko-ACA, wie z. B. i(17q) und -7/7q-, schlecht auf TKIs ansprechen und ein höheres Risiko für eine Krankheitsprogression haben. -7/7q- kommen in BC seltener vor als i(17q), haben jedoch einen größeren ungünstigen Einfluss auf die Prognose30. Der Patient Nummer 3 mit mehreren Deletionen im Chromosom 7 hat eine kürzere Zeit bis zum MBC.
WT1-R435X ist eine weitere signifikante Nonsens-Variante, die beim dritten Patienten entdeckt wurde. WT1 ist ein Tumorsuppressorgen, dessen Funktion als Transkriptionsregulator bekannt ist31. Diese Mutation verursacht einen Funktionsverlust in WT1 durch die Aktivierung des NMD-Mechanismus (Nonsense Mediated Decay). Mutationen in WT1 wurden in der Blastenphase CML32, im Wilms-Tumor und im desmoplastischen kleinen rundzelligen Tumor (COSM21401) berichtet. Pathogene Varianten dieses Gens korrelieren mit einer schlechten Prognose bei Patienten mit myelodysplastischen Syndromen33. Die p.R435X-Keimbahnmutation in WT1 wurde als pathogen eingestuft und steht im Zusammenhang mit dem Wilms-Tumor im Clinvar (RCV000003671).
In ASXL1 wurden zwei Frameshift-Einzelnukleotiddeletionen identifiziert (A627Gfs*8, G646Wfs*12). ASXL1-Mutationen kommen bei sekundärer AML häufiger vor und können zur Entwicklung von CML zu AML beitragen. Darüber hinaus könnte die ASXL1-Mutation mit einem aggressiven Phänotyp bei myeloischen Malignomen verbunden sein4.
Es wurde gezeigt, dass Mutationen in der ABL1-Kinasedomäne, ASXL1, IKZF1 und TP53 häufig bei CML-Patienten auftreten, die BC12,30,34 entwickeln. Die ASXL1-Mutation ist die häufigste Mutation bei Patienten mit schlechtem Outcome. Darüber hinaus dauerte es bei Personen mit einer ASXL1-Mutation im Mittel länger, BC12 zu entwickeln. In der aktuellen Studie hatten der erste und der zweite Patient mit ASXL1-Mutation eine längere Zeit bis zum MBC als der dritte Patient.
Die Deletion des EZH2-Gens wurde durch Chromosomensequenzierung beim dritten Patienten festgestellt. Das EZH2-Gen ist ein epigenetisches Regulatorgen (H3K27-Methyltransferase). Funktionsverlustmutationen in EZH2 wurden bei primärer Myelofibrose (PMF), MDS und MDS/MPN-Überlappungssyndromen berichtet27.
Bei den Tumorsuppressorgenen wurden mehrere wichtige Varianten dokumentiert, insbesondere bei den Genen, die an den DNA-Schadenserkennungs- und DNA-Reparaturwegen beteiligt sind, darunter CHEK2, ATM und BRCA2. Die CHEK2 c.-4C > T-Variante ist eine wichtige Tier3-Variante. CHEK2 spielt eine Rolle bei der Erkennung und Reparatur von DNA-Schäden, dem Zellzyklus und dem P53-Signalweg. Die c.-4C > T-Variante befindet sich in der Kozak-Sequenz, was die Translation beeinflussen kann35. Diese Variante wurde in Clinvar als VUS für das erbliche krebsprädisponierende Syndrom (RCV000131287) gemeldet.
Die ATM-C117Y-Variante ist eine Tier2-Missense-Variante. ATM ist an der homologen Rekombination, dem Zellzyklus und dem P53-Signalweg36 beteiligt. ATM spielt eine Schlüsselrolle im DNA-Schadensreaktionsweg und Funktionsverlustmutationen bei ATM können die Explosionskrise bei CML beschleunigen37. Es wurde gezeigt, dass die ATM-CHEK2-p53-Achse eine wichtige Rolle bei der Krebsentstehung spielt, indem sie Apoptose, Zellzyklusstillstand oder Seneszenz in den Krebszellen induziert27.
Die BRCA2-P3292L-Variante ist eine Missense-Tier2-Variante. BRCA2 ist ein Tumorsuppressorgen, das zur homologen Rekombination beiträgt38. Es wurde darauf hingewiesen, dass 20 % der Brustkrebsüberlebenden mit therapiebedingten myeloischen Neoplasien (t-MN) eine Keimbahnmutation in den Genen BRCA1/2, CHEK2, TP53 oder PALB2 aufweisen, die für DNA-Reparaturwege wichtig sind27 .
PRPF8 war das einzige RNA-Spleißfaktor-Gen mit einer signifikanten Variante. Es ist eine Kernkomponente der Spleißosomenkomplexe vom U2-Typ und U12-Typ39. Bei der PRPF8-G1796R-Variante beim zweiten Patienten handelt es sich um eine Missense-Tier3-Variante. Diese Variante wurde als Treibermutation eingestuft und wurde bisher nicht gemeldet.
Die Selbsterneuerung, Differenzierung und Proliferation sind drei Hauptprozesse, die bei bösartigen Erkrankungen beeinträchtigt sind. In der aktuellen Studie wurden durch die integrierte Genomsequenzierung wichtige Varianten in zwölf verschiedenen Krebsgenen nachgewiesen. Mutationen in Signalgenen können die Proliferation bösartiger Zellen induzieren, während Mutationen in den epigenetischen Regulatoren (ERs) oder Tumorsuppressorgenen (TSG) die Selbsterneuerung in den Vorläuferzellen fördern können und Mutationen in Transkriptionsfaktoren die Differenzierung beeinflussen können. Mutationen in der Spleißosomenkomponente können auch zur Differenzierung und Selbsterneuerung von Vorläuferzellen führen40. Daher können die Veränderungen in den Signalmolekülen ABL1, PTPN11 und PIK3CB den Proliferationsprozess bei MBC-CML verstärken. Varianten der Tumorsuppressorgene CHEK2, BRCA2 und ATM sowie der epigenetischen Regulatoren ASXL1 und EZH2 können die Selbsterneuerung der proliferierenden Vorläufer unterstützen. Varianten der Transkriptionsfaktoren GATA2, PHF6, WT1, IKZF1 und CUX1 können als Differenzierungsblocker wirken. Schließlich kann die Variante im PRPF8 als Spleißosomenkomponente als Differenzierungsblocker wirken oder eine Selbsterneuerung des proliferierenden Vorläufers bewirken.
Schließlich zeigte ein aktuelles integriertes Modell der Explosionskrise41, dass einer der wichtigsten Mechanismen im Zusammenhang mit der BC-Progression die epigenetische Neuprogrammierung im Zusammenhang mit der abnormalen Funktion des Polycomb Repressive Complex (PRC) ist. Die Komponenten des PRC-Komplexes als epigenetischer Komplex unterdrücken die Expression bestimmter Gene, einschließlich des leukämogenen HOXA-Clusters. Andererseits interagieren bestimmte Genprodukte mit PRC-Komponenten, um repressive Markierungen hinzuzufügen/zu entfernen oder PRC-Komponenten an bestimmte Orte zu rekrutieren. Basierend auf aktuellen Studien zum BC-Genom und -Transkriptom wurde gezeigt, dass die Komponenten des PRC-Komplexes mutiert bzw. in ihrer Expression verändert sind. Diese Veränderungen wirken sich insgesamt auf die Genexpressionssignatur von BC-Zellen aus. ASXL1-Genprodukte interagieren mit PRC2-Komponenten, einschließlich EZH2. IKZF1 rekrutiert auch PRC2 an den Zielgenorten. Nach diesem Modell könnten die Frameshift-Mutationen im ASXL1 beim ersten und zweiten Patienten eine entscheidende Rolle bei der BC-Progression spielen. Beim dritten Patienten können die großen Deletionen im Chromosom 7, die IKZF1 (7p12.2) und EZH2 (7q35-q36) betreffen, BC beschleunigen.
Ein vorgeschlagenes Modell der Leukämogenese für die Ereignishierarchie ist in Abb. 5 dargestellt. In diesem Modell ist der erste Schritt das Vorhandensein leicht schädlicher Varianten (VUS-P), hauptsächlich in den Tumorsuppressorgenen (TSG)/DNA-Schadensreparatur (DDR)-Gene, Transkriptionsfaktoren (TF) und/oder Komponenten des Splisosoms. Diese Varianten können die Anfälligkeit und Veranlagung des Einzelnen für bösartige Erkrankungen erhöhen. Das BCR-ABL1-Fusionsgen und Mutationen in den Genen des epigenetischen Regulators (ER)/Transkriptionsfaktors (TF), die hauptsächlich die Funktion von PRC beeinflussen, sind die wichtigsten genetischen Entdeckungen im zweiten und dritten Schritt. Der letzte Schritt in der Phase der beschleunigten Krise und der Explosionskrise kann durch Mutationen in Signalmolekülen und/oder zusätzliche chromosomale Anomalien (ACAs) eingeleitet werden. ABL1-Mutationen speziell in der Kinasedomäne führen zu einer TKI-Resistenz und eine Verzögerung beim TKI-Wechsel kann die Prognose und das Überleben in der Explosionskrise beeinträchtigen. ACAs, an denen leukämogene Gene (wie ER, TF oder TSG) beteiligt sind, können ebenfalls die klinische Prognose verschlechtern und die Krankheit in die Blastenphase überführen.
Ein vorgeschlagenes Modell der Leukämogenese. In diesem Modell ist der erste Schritt das Vorhandensein leicht schädlicher Varianten, die die Tumorsuppressorgene (TSG), Transkriptionsfaktoren (TF) und/oder Komponenten des Splisosoms beeinflussen und die Krebsanfälligkeit erhöhen können. Im zweiten und dritten Schritt sind die wichtigsten genetischen Befunde das BCR-ABL1-Fusionsgen und die Mutation in den Genen des epigenetischen Regulators (ER)/Transkriptionsfaktors (TF). Der letzte Schritt in der Phase der beschleunigten Krise und der Explosionskrise kann durch Mutationen in den Signalmolekülen und/oder zusätzliche chromosomale Anomalien (ACAs) eingeleitet werden.
Obwohl Mutationen in ASXL1- oder IKZF1-Genen eine Schlüsselrolle bei BC spielen können, werden sie zum Zeitpunkt der Diagnose in der chronischen Phase häufiger gefunden, bei Personen mit schlechter Prognose. Daher können Mutationen in Onkogenen wie ABL1 und PTPN11 als Beschleuniger wirken.
In dieser Studie waren keine Proben zu den verschiedenen Phasen des Krankheitsverlaufs verfügbar. Zukünftige Studien, die die Genomsequenzierung zu verschiedenen Zeitpunkten nutzen, könnten es ermöglichen, die Abfolge von Ereignissen im Zusammenhang mit dem Krankheitsverlauf zu ermitteln. Darüber hinaus könnten jüngste Fortschritte bei der Einzelzellsequenzierung dazu beitragen, die Krankheitsmechanismen genauer aufzuklären.
Die integrierte Genomsequenzierung in dieser Studie identifizierte effektiv ein großes Spektrum wichtiger und umsetzbarer Varianten von SNVs bis CNVs. Leicht schädliche Passagiervarianten, hauptsächlich in DNA-Schadensreparatur-Genen (DDR), können die Krebsanfälligkeit des Einzelnen erhöhen. BCR-ABL1-Fusion, Mutationen in Signal- und epigenetischen Regulatorgenen sowie ACAs können als Krebstreiber wirken. Die durch ASXL1- oder IKZF1-Mutationen verursachte epigenetische Neuprogrammierung scheint einer der kritischsten Mechanismen im Zusammenhang mit der BC-Entwicklung zu sein. ABL1-Domänenmutationen, Mutationen in anderen Signalgenen und Hochrisiko-ACAs können CML zu BC begünstigen.
Mit dieser Strategie haben wir mehrere umsetzbare Erkenntnisse identifiziert, die gezielte Therapien verbessern können. Diese Ergebnisse können dazu beitragen, die zugrunde liegenden pathophysiologischen Mechanismen besser zu verstehen, und könnten in Zukunft weitere Einblicke in die genetischen Grundlagen von MBC-CML liefern. Weitere Studien werden Aufschluss über den klinischen Nutzen der integrierten Genomanalyse geben.
Die während der aktuellen Studie generierten und/oder analysierten Datensätze sind in der ENA https://www.ebi.ac.uk/ena/browser/view/PRJEB51084 verfügbar.
Eine Korrektur zu diesem Artikel wurde veröffentlicht: https://doi.org/10.1038/s41598-023-27872-1
Beschleunigte Phase
Tiefe der Abdeckung
Amerikanische Hochschule für medizinische Genetik und Genomik
Amerikanische Gesellschaft für klinische Onkologie
Verein für Molekulare Pathologie
Gutartig
Knochenmark Aspiration
Chronisch-myeloischer Leukämie
Interpreter des Krebsgenoms
College amerikanischer Pathologen
Nummernvariation kopieren
Diagnose
Treiber
Epigenetische Regulatoren
Toolkit zur Genomanalyse
Bekannter Fahrer
Leukämie-Vorläuferzelle
Leukämie-Stammzelle
Wahrscheinlich harmlos
Wahrscheinlich pathogen
Myelodysplastisches Syndrom
Myeloische Explosionskrise
Massiv parallele Sequenzierung
Myeloproliferative Neoplasien
Sequenzierung der nächsten Generation
Nicht proteinbeeinflussend
Passagier
Pathogen
Peripheren Blut
Möglicherweise wichtige Erkenntnis
Möglicherweise umsetzbarer Befund
Reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion
Einzelnukleotidvariante
Transkriptionsfaktor
Tumorsuppressorgen
Variante mit ungewisser Bedeutung
Variante mit ungewisser Bedeutung, die gutartig ist
Variante mit ungewisser Bedeutung, tendenziell pathogen
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Die Autoren geben an, dass kein Interessenkonflikt besteht. Unser aufrichtiger Dank geht an Professor Ghavamzadeh, Dr. Shahrbanoo Keyhanian, Dr. Abolghasem Kollaee, Dr. CP.
Diese Studie ist Teil einer Doktorarbeit, die von der iranischen Universität für medizinische Wissenschaften finanziert wurde (Nummer: 95-04-87-30235). Diese Studie wurde teilweise vom Cellular and Molecular Research Center der Iranischen Universität für medizinische Wissenschaften unterstützt (Nummer: 97-01-117-33428).
Diese Autoren trugen gleichermaßen bei: Golnaz Ensieh Kazemi-Sefat und Mohammad Keramatipour.
Abteilung für Molekulare Medizin, Fakultät für fortgeschrittene Technologien in der Medizin, Iranische Universität für Medizinische Wissenschaften, Teheran, Iran
Golnaz Ensieh Kazemi-Sefat
Zentrum für Zell- und Molekularforschung, Iranische Universität für Medizinische Wissenschaften, Teheran, Iran
Golnaz Ensieh Kazemi-Sefat & Kazem Mousavizadeh
Abteilung für Medizinische Genetik, Medizinische Fakultät, Medizinische Universität Teheran, Teheran, Iran
Mohammad Keramatipour
Forschungszentrum für Hämatologie, Onkologie und Stammzelltransplantation, Shariati-Krankenhaus, Medizinische Universität Teheran, Teheran, Iran
Mohammad Vaezi, Shahrbano Rostami, Marjan Yaghmaie und Bahram Chahardouli
Onkopathologisches Forschungszentrum, Medizinische Fakultät, Iranische Universität für Medizinische Wissenschaften, Teheran, Iran
Seyed Mohsen Razavi
Labor für komplexe biologische Systeme und Bioinformatik (CBB), Abteilung für Bioinformatik, Institut für Biochemie und Biophysik (IBB), Universität Teheran, Teheran, Iran
Kaveh Kavousi
Abteilung für Medizinische Genetik, Medizinische Fakultät, Mashhad University of Medical Sciences, Mashhad, Iran
Amen-Anfrage
Abteilung für Medizinische Genetik, Medizinische Fakultät, Iranische Universität für Medizinische Wissenschaften, Teheran, Iran
Saeed Talebi
Abteilung für Pharmakologie, Medizinische Fakultät, Iranische Universität für Medizinische Wissenschaften, Teheran, Iran
Kazem Mousavizadeh
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GEKS hat an der Konzeption und Datenanalyse mitgewirkt, die Arbeit entworfen und das Manuskript verfasst. MK war an der Konzeption und Datenanalyse beteiligt. KM hat an der Konzeption mitgewirkt, das Projekt betreut und die Untersuchung gefördert. ST schlug die wichtigsten konzeptionellen Ideen und eine geprüfte Gliederung vor und überprüfte und überarbeitete den Artikel kritisch auf wichtige intellektuelle Inhalte. MV und SMR spielten eine Rolle bei der klinischen Behandlung des Patienten und trugen zur klinischen Analyse bei. KK war an der NGS-Datenanalyse beteiligt. AT gab kritisches Feedback und trug zur NGS-Datenanalyse bei. Sh.R, MY und B.Ch trugen zur Durchführung hämatologischer, zytogenetischer und immunphänotypisierender Studien und der damit verbundenen Datenanalyse bei. Alle Autoren haben das endgültige Manuskript gelesen und genehmigt. Golnaz Ensieh Kazemi Sefat (GEKS) und Mohammad Keramatipour (MK) trugen zu gleichen Teilen als Erstautoren bei. Saeed Talebi (ST) und Kazem Mousavizadeh (KM) trugen gleichermaßen als korrespondierende Autoren bei. Alle Autoren haben das Manuskript überprüft.
Korrespondenz mit Saeed Talebi oder Kazem Mousavizadeh.
Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.
Springer Nature bleibt neutral hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten.
Die ursprüngliche Online-Version dieses Artikels wurde überarbeitet: Die ursprüngliche Version dieses Artikels enthielt Fehler in der Schreibweise der Autoren Shahrbano Rostami und Marjan Yaghmaie, die fälschlicherweise als Shahrbanoo Rostami bzw. Marjan Yaghmaei angegeben wurden.
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Nachdrucke und Genehmigungen
Kazemi-Sefat, GE, Keramatipour, M., Vaezi, M. et al. Die integrierte Genomsequenzierung bei chronischer myeloischer Leukämie (MBC-CML) mit myeloischer Explosionskrise identifizierte potenziell wichtige Erkenntnisse im Kontext des Leukämogenesemodells. Sci Rep 12, 12816 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-17232-w
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Eingegangen: 14. März 2022
Angenommen: 21. Juli 2022
Veröffentlicht: 27. Juli 2022
DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-17232-w
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