Exon

Scientific Reports Band 6, Artikelnummer: 18741 (2016) Diesen Artikel zitieren

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ATM ist ein wichtiges Krebsanfälligkeitsgen, das eine entscheidende apikale Kinase des DNA Damage Response (DDR)-Signalwegs kodiert. Wir zeigen, dass ein wichtiges Nonsense-vermitteltes RNA-Zerfallsschalter-Exon (NSE) in ATM durch U2AF, PUF60 und hnRNPA1 unterdrückt wird. Die NSE-Aktivierung war Haplotyp-spezifisch und wurde am stärksten durch Cytosin bei rs609261 in der NSE-3′-Spleißstelle (3′ss) gefördert, die in Populationen mit hohem Krebsrisiko vorherrschend ist. Die NSE-Spiegel waren bei Leukämien dereguliert und wurden durch die Identität des U2AF35-Rests 34 beeinflusst. Wir identifizieren auch Spleiß-Switching-Oligonukleotide (SSOs), die die Konkurrenz benachbarter Pseudoexons ausnutzen, um die NSE-Spiegel zu modulieren. Die U2AF-regulierte Exon-Nutzung im ATM-Signalweg konzentrierte sich auf die MRN/ATM-CHEK2-CDC25-cdc2/Cyclin-B-Achse und betraf bevorzugt Transkripte, die an krebsassoziierten Genfusionen und chromosomalen Translokationen beteiligt sind. Diese Ergebnisse zeigen wichtige Zusammenhänge zwischen der 3′ss-Kontrolle und ATM-abhängigen Reaktionen auf Doppelstrang-DNA-Brüche, zeigen die funktionelle Plastizität intronischer Varianten und veranschaulichen die Vielseitigkeit intronischer SSOs, die auf Pseudo-3′ss abzielen, um die Genexpression zu modifizieren.

Introns werden durch einen großen und hochdynamischen RNA-Protein-Komplex namens Spleißosom entfernt, der komplexe Wechselwirkungen zwischen Primärtranskripten, kleinen Kern-RNAs (snRNAs) und einer großen Anzahl von Proteinen koordiniert1. Spleißosomen ordnen sich ad hoc auf jedem Intron in geordneter Weise an, beginnend mit der Erkennung der 5'-Spleißstelle (5's) durch U1-snRNA oder der 3'ss durch den U2-Weg1,2, was die Bindung des U2-Hilfsfaktors beinhaltet ( U2AF) in die 3′ss-Region, um die U2-Erkennung der Verzweigungspunktsequenz (BPS)3 zu erleichtern. U2AF ist ein stabiles Heterodimer, das aus einer U2AF2-kodierten 65-kD-Untereinheit (U2AF65), die den Polypyrimidintrakt (PPT) bindet, und einer U2AF1-kodierten 35-kD-Untereinheit (U2AF35) besteht, die mit hochkonservierten AG-Dinukleotiden bei 3‘ interagiert. ss und stabilisiert die U2AF65-Bindung4. Zusätzlich zur BPS/PPT-Einheit und 3′ss/5′ss erfordert genaues Spleißen Hilfssequenzen oder -strukturen, die die Erkennung der Spleißstelle aktivieren oder unterdrücken, sogenannte intronische oder exonische Spleißverstärker oder Silencer. Diese Elemente ermöglichen die Erkennung echter Spleißstellen unter einem riesigen Übermaß an kryptischen oder Pseudostellen im Genom höherer Eukaryoten, die ähnliche Sequenzen aufweisen, aber authentische Stellen um eine Größenordnung zahlreicher übertreffen5. Obwohl sie oft eine regulatorische Funktion haben6, sind die molekularen Mechanismen ihrer Unterdrückung kaum verstanden.

Exomsequenzierungsstudien haben ein eingeschränktes Muster somatischer Mutationen in U2AF1/U2AF2 und anderen Genen ergeben, die an der 3′ss-Erkennung in Krebszellen beteiligt sind, einschließlich SF3B1, ZRSR2, SF1, SF3A1, PRPF40B und SRSF2 (Übersicht in 7). Diese Gene kodieren für Produkte, die häufig beim Zusammenbau von Spleißosomen interagieren8,9,10 und einen hohen Grad an gegenseitiger Ausschließlichkeit krebsassoziierter Mutationen aufweisen7, was auf die Existenz eines gemeinsamen onkogenen Signalwegs hinweist. Transkriptom-Profiling bei Leukämien, die diese Mutationen tragen, hat zahlreiche Veränderungen beim Spleißen von mRNA-Vorläufern festgestellt7, aber wichtige Zusammenhänge zwischen spezifischen RNA-Verarbeitungsdefekten und der Entstehung oder dem Fortschreiten von Krebs sind trotz des großen Potenzials dieser Ziele für eine therapeutische Modulation unklar geblieben. Darüber hinaus war unklar, warum das stark eingeschränkte Mutationsmuster in diesen Zellen nicht mit einer begrenzten und klar definierten Reihe von RNA-Verarbeitungsdefekten mit onkogenen Eigenschaften in Verbindung gebracht wurde. Darüber hinaus wurde die Exon-Verwendung in DDR-Genen, die bei der malignen Transformation eine entscheidende Rolle spielen, in Zellen, denen 3′ss-Prozessierungsfaktoren fehlen, nicht vollständig charakterisiert, und natürliche DNA-Varianten, die ihre Aktivierung beeinflussen, sind unbekannt.

Hier identifizieren wir ein U2AF-unterdrücktes NMD-Switch-Exon (Nonsense-Mediated Decay) in ATM (Ataxia-Teleangiectasia, AT, mutiert). Wir zeigen, dass das Ausmaß, in dem dieses Ereignis die ATM-Expression einschränkt, weitgehend von einer häufigen intronischen Variante rs609261 abhängt, die sich im NSE 3′ss befindet. Durch die Nutzung neuartiger intronischer cis-Elemente, die die NSE-Einschlussniveaus steuern, identifizieren wir SSOs, die die NSE-Aktivierung modulieren, indem sie auf ein konkurrierendes Pseudoexon im selben Intron abzielen. Darüber hinaus identifizieren wir U2AF-verwandte Proteine, die die NSE-Selektion steuern. Mithilfe von RNA-Seq zeigen wir auch, dass die U2AF-vermittelte Regulierung von DDR-Signalwegen auf der ATM-CHEK2-CDC25-cdc2/Cyclin-B-Achse zentriert ist, was darauf hindeutet, dass sie sich gemeinsam mit zellulären Reaktionen auf Doppelstrang-DNA-Brüche (DSBs) entwickelt hat ). Schließlich zeigen wir eine bevorzugte Beteiligung von U2AF-regulierten Transkripten an krebsassoziierten Genfusionen und Chromosomentranslokationen.

Wir und andere haben kürzlich gezeigt, dass die Erschöpfung jeder U2AF-Untereinheit zu einer Herunter- und Hochregulierung einer großen Anzahl von Exons führte, die überwiegend alternativ gespleißt waren11,12. Bei der Untersuchung globaler RNA-Verarbeitungsänderungen in Zellen, denen U2AF35 fehlt, fanden wir eine unerwartet starke Aktivierung eines kryptischen 29-nt-ATM-Exons, das nicht von RefSeq annotiert wurde (genannt NSE für NMD-Switch-Exon, Abb. 1a). Die NSE-Aktivierung wurde auch in Zellen beobachtet, denen jede U2AF35-Isoform einzeln mit isoformspezifischen kleinen interferierenden RNAs (siRNAs) entzogen wurde, und mit SSOs, die auf 3′ss der alternativ gespleißten U2AF1-Exons Ab und 3 abzielten, die jeweils für die Isoformen U2AF35b und U2AF35a kodieren (Abb . 1a). Die Validierung der RNA-Seq-Daten mittels RT-PCR zeigte, dass NSE in etwa 10–20 % der polyadenylierten Transkripte in unbehandelten humanen embryonalen Nierenzellen (HEK) 293 vorhanden war, ähnlich den in lymphoblastoiden Zelllinien beobachteten Werten13. Die NSE-Einschlusswerte stiegen in Kulturen, denen etwa 90 % U2AF35 fehlten, auf etwa 75 % und in Zellen, denen etwa 75 % U2AF65 entzogen waren, auf etwa 50 % (Abb. 1b), waren von der siRNA-Dosis abhängig und korrelierten umgekehrt mit der geschätzten verfügbaren Menge U2AF-Heterodimere (Abb. 1c), im Einklang mit der Anforderung jeder U2AF-Untereinheit an NSE-Repression. RNA-Seq-Daten zeigten auch die Beibehaltung von Intronsequenzen rund um NSE (Abb. 1a), jedoch nicht benachbarter Introns, was darauf hindeutet, dass Intron 28 „festgehalten“ wird und nach der Transkription gespleißt werden könnte14. Die Retentionsniveaus von Intron 28 wurden weder durch SSO- noch durch siRNA-vermittelte Depletion von U2AF35 beeinflusst (Abb. 1a), und kein anderes kryptisches Exon in diesem Gen wurde im gleichen Ausmaß wie NSE aktiviert. Somit spielt NSE eine wichtige Rolle bei der exonzentrischen Regulierung der ATM-Expression durch U2AF.

Identifizierung eines U2AF-reprimierten kryptischen Exons im ATM-Intron 28. (a) Schematische Darstellung der NSE-Aktivierung. Die NSE-Sequenz (oberes Feld) ist eingerahmt, das Sternchen bezeichnet rs609261, schwarze Rechtecke zeigen die angegebenen Antisense-Oligonukleotide. Genombrowseransichten von RNA-Seq-Daten aus RNAi- oder SSO-vermittelten Depletionen beider U2AF35-Isoformen (ab-), U2AF35a (a-), U2AF35b (b-) und Kontrollen (c) werden im unteren Bereich angezeigt. SSOs, die auf 3′-SS der U2AF1-Exons Ab und 3 und U2AF35-siRNAs abzielten, waren wie beschrieben11. Y-Achse, Dichten ablesen. Der Einschluss/Ausschluss von NSE wird schematisch durch gepunktete Linien oben dargestellt. ATM-Exons (graue Kästchen) sind wie in Lit. nummeriert. 13. Das 29-nt-NSE führte ein Stoppcodon in die ATM-mRNA ein. (b) Validierung der NSE-Aktivierung durch RT-PCR (oberes Feld) in unabhängigen Depletionen (unteres Feld). RT-PCR-Primer (ATM-F, ATM-R, Tabelle S1) sind in Tafel a durch Pfeile gekennzeichnet. Gespleißte Produkte werden rechts angezeigt, der Prozentsatz der Transkripte mit NSE steht oben. Fehlerbalken kennzeichnen SDs von zwei Transfektionsexperimenten. ***p < 0,0001, **p < 0,001. (c) Der Einschluss von NSE in reife Transkripte korreliert umgekehrt mit dem restlichen U2AF. r, Pearson-Korrelation. Die Schätzungen der Heterodimerspiegel erfolgten wie beschrieben11.

Die Untersuchung der Genomsequenzen rund um NSE ergab, dass Position -3 relativ zum NSE 3′ss bei rs609261 polymorph ist, wobei Thymin (T) in afrikanischen und asiatischen Populationen und Cytosin (C) in Kaukasiern vorherrscht (Abb. 2a). Die Basenidentität an dieser Position ist entscheidend für die universelle Exon-Erkennung, mit einer CAG>TAG>AAG>GAG-Hierarchie der Exon-Einschlussebenen beim 3′ss-Konsens15. Um zu bestätigen, dass die NSE-Verwendung allelspezifisch ist, untersuchten wir das Spleißen von zwei Reporterkonstrukten, die C oder T an dieser Position enthielten, nach vorübergehenden Transfektionen in HEK293-Zellen (Abb. 2b). Wie erwartet ergab das T-Konstrukt einen geringeren NSE-Einschluss als der C-Reporter, sowohl in unbehandelten Zellen als auch in Zellen, denen jede U2AF-Untereinheit einzeln entzogen war (Abb. 2c).

NSE-Aktivierung und ATM-Ausdruck werden durch rs609261 geändert. (a) Allelfrequenzen bei rs609261 in den angegebenen Populationen66. (b) Minigen-Schaltpläne. Ein XhoI/XbaI-Segment von ATM, das NSE und Exon 29 enthielt, wurde zwischen den U2AF1-Exons 2 und 4 (schwarze Kästchen) kloniert. RT-PCR-Primer zur Amplifikation exogener Transkripte (PL3 und ATM-R, Tabelle S1) sind durch Pfeile gekennzeichnet. (c) Die rs609261-abhängige NSE-Aktivierung in exogenen Prä-mRNAs. HEK293-Zellen, denen U2AF35 oder U2AF65 entzogen waren, wurden vorübergehend mit T- (schwarz) und C- (grau) Minigenen transfiziert. Die Endkonzentration der U2AF35- und U2AF65-siRNAs betrug 30 bzw. 60 nM. (d) Identifizierung von Zelllinien, die homozygot bei rs609261 (Sternchen) sind. NSE ist verpackt. (e,f) Die allelspezifische Aktivierung von NSE in endogenen Transkripten begrenzt die ATM-Expression dosisabhängig. Die Quelle der endogenen Transkripte befindet sich unten, die Antikörper befinden sich rechts. Die Konzentration der siRNAs in HEK293-Kulturen betrug 3, 10 und 30 nM. Die Konzentration der siRNAs in HeLa-Kulturen betrug 6,6, 20 und 60 nM. C1, C2, Kontroll-siRNAs. Die Transfektionseffizienz wurde durch ein GFP-Plasmid und Fluoreszenzmikroskopie überwacht. (g) UPF1-Depletion erhöhte NSE-Aktivierung (oberes Feld) und hochregulierte Isoform U2AF1c (unteres Feld). Die U2AF1c-Isoform enthält beide Exons Ab und 3 und wird durch NMD11,67 unterdrückt. Die Endkonzentration der UPF1-siRNA betrug 7, 20 und 60 nM. SC, eine verschlüsselte Kontrolle. Fehlerbalken sind SDs unabhängiger Transfektionen. (h) NSE-Einschlussniveaus in Zellen, denen U2AF-verwandte Proteine ​​und eine Untergruppe heterogener nuklearer RNPs entzogen sind. Fehlerbalken kennzeichnen SDs von zwei Transfektionen. Rechts sind Immunblots dargestellt. Die Endkonzentration der U2AF35-siRNA betrug 25 nM; die restlichen siRNAs lagen bei 60 nM. C, Kontrollen. (i) Überexpression von PUF60 induzierte NSE-Skipping. Immunoblots sind unten dargestellt, Antikörper rechts.

Um zu testen, ob die Allel-spezifische NSE-Verwendung zu einer unterschiedlichen Proteinexpression in Zellen führt, denen U2AF35 fehlt, haben wir zunächst DNA aus verfügbaren Zelllinien über rs609261 sequenziert, um transfizierbare Zellen zu erhalten, die für jedes Allel homozygot sind. Wir fanden heraus, dass HEK293-Zellen homozygot für das C-Allel und HeLa-Zellen homozygot für das T-Allel waren (Abb. 2d). Immunoblots von U2AF35-depletierten Zellen und unbehandelten Kontrollen bestätigten eine effiziente Depletion in jeder Zelllinie und einen stärkeren U2AF-vermittelten Rückgang der ATM-Expression in Gegenwart des C-Allels als des T-Allels (Abb. 2e, f und Abb. S1a – c). ). Die Abreicherung von UPF1, einer Schlüsselkomponente des NMD-Signalwegs, zeigte einen dosisabhängigen Anstieg des NSE-Einschlusses in ATM-mRNAs (Abb. 2g). Auf Immunoblots von abgereicherten Zellen wurde kein Signal von einem mutmaßlich verkürzten ATM nachgewiesen.

Da U2AF-reprimierte und -aktivierte Exons bevorzugte Reaktionen auf U2AF-verwandte Proteine ​​zeigen, haben wir HEK293-Zellen von PUF60 und CAPERα sowie mehreren heterogenen nuklearen Ribonukleoproteinen, einschließlich hnRNP A1, abgereichert. PUF60 interagiert mit uridinreichen Motiven an 3′ss16 und hnRNP A1 bildet einen ternären Komplex mit U2AF auf AG-haltigen U-reichen RNAs17. Die Erschöpfung von PUF60 oder hnRNP A1 erhöhte den NSE-Einschluss (Abb. 2h), während die Überexpression von PUF60 zum Überspringen von NSE führte (Abb. 2i). Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass die rs609261- und bevölkerungsabhängige NSE-Aktivierung tief im ATM-Intron 28 durch U2AF, PUF60 und hnRNP A1 reguliert wird und zeigen, dass die Funktionalität eines gemeinsamen intronischen Polymorphismus mit den zellulären Konzentrationen von RNA-bindenden Proteinen variiert, die 3 ermöglichen ′ss Anerkennung.

Um zu testen, ob die NSE-Aktivierung in Zellen ohne U2AF unterdrückt werden kann, um die ATM-Expression wiederherzustellen, haben wir zunächst das C-Allel-Reporterkonstrukt einzeln mit SSOs cotransfiziert, die auf NSE-Spleißstellen abzielen (Abb. 1a). SSOs wurden mit Phosphorothioatbindungen an jedem Ende und mit 2'-O-Methyl an jeder Ribose modifiziert und sollten die PPT von NSE, stabilen Mfold-vorhergesagten Stämmen und rs609261 vermeiden. Jedes SSO verringerte den NSE-Einschluss dosisabhängig sowohl in exogenen (Abb. 3a) als auch in endogenen (Abb. 3b) Transkripten, und das SSO, das auf die NSE 3's abzielte, war effizienter als das SSO, das gleichzeitig seine 5's überbrückte Konzentrationen.

Rettung des U2AF-unterdrückten ATM-Ausdrucks durch SSOs, die auf NSE abzielen. (a,b) Effiziente SSO-vermittelte NSE-Hemmung in exogenen (a) und endogenen (b) ATM-Transkripten. Die mittleren NSE-Einschlussniveaus von zwei Transfektionsexperimenten sind in den rechten Feldern dargestellt. (c) Wiederherstellung der ATM-Proteinspiegel durch SSOs, die den Zugang zu NSE blockieren. Zellen ohne U2AF35 und Kontrollzellen wurden mit dem SSO transfiziert, das auf die NSE 3 und Kontroll-SSOs abzielte (Abb. 1a und Tabelle S1), wie beschrieben61,68. Nach 48 Stunden wurden die Zellen ionisierender Strahlung (IR, 10 Gy) ausgesetzt und eine Stunde später geerntet. Zelllysate wurden mithilfe einer Gradienten-SDS-PAGE aufgetrennt. Western Blot wurde mit den rechts gezeigten Antikörpern durchgeführt. (d) SSO-NSE3-vermittelte Verstärkung des ATM-Proteins in Zelllinien, die bei rs609261 homozygot sind. Die Säulen stellen den durchschnittlichen Unterschied in der ATM-Expression zwischen SSO-NSE3-behandelten und SSO-C-behandelten homozygoten Zellen dar, denen U2AF35 fehlt. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung zweier biologischer Replikate dar. P-Werte zum Vergleich von SSO-C mit SSO-NSE3-behandelten Gegenstücken werden oben angezeigt. Repräsentative Immunoblots sind in Abb. S1a, b dargestellt.

Als nächstes untersuchten wir, ob das NSE 3′ss SSO die ATM-Proteinexpression erhöhen kann. Die verringerte ATM-Expression in Zellen ohne U2AF35 wurde durch dieses SSO in HEK293-Zellen teilweise behoben, dies war jedoch in HeLa-Zellen nicht erkennbar, wo die NSE-Aktivierung und -Rekonstitution bei denselben SSO-Konzentrationen weniger effizient war (Abb. S1a und S1b, Spuren 5–8). vs. 9–12; Abb. S1c). Wir haben auch getestet, ob das SSO NSE3 Downstream-ATM-Ziele in HEK293-Zellen beeinflussen kann, die ionisierender Strahlung (IR) ausgesetzt sind. Die niedrige ATM-Expression in Zellen ohne U2AF35 wurde durch dieses SSO teilweise auch in IR-exponierten Zellen behoben (Abb. 3c, Spuren 1 vs. 2 und 5 vs. 6 und Abb. S1e, Spuren 5–8 vs. 9–12). Nach der IR war der an S198118 autophosphorylierte aktivierte ATM in abgereicherten Zellen im Vergleich zu unbehandelten Zellen verringert (Abb. S1e, Spuren 1–4 vs. 5–8 und Abb. 3c, Spur 6 vs. 8), und dieses Signal schien nach der Exposition auch leicht erhöht zu sein zum NSE 3′ss SSO (Abb. S1e, Spuren 5–8 vs. 9–12 und Abb. 3c, Spur 5 vs. 6). Wir überexprimierten auch Wildtyp-CHEK2 in (schein)bestrahlten Zellen, denen U2AF entzogen war, eine Serin/Threonin-Kinase, die durch ATM bei T68 als Reaktion auf DSBs19 phosphoryliert wurde. Zellen ohne U2AF wiesen im Vergleich zu Kontrollen deutlich geringere Mengen an endogenem CHEK2 auf, die durch das NSE 3′ss-SSO offenbar nicht verändert wurden (Abb. S1e, Spuren 1–12). Im Gegensatz dazu war exogenes CHEK2 in abgereicherten Zellen sowohl in IR-exponierten als auch in IR-exponierten Zellen erhöht (Spuren 1–4 vs. 5–8, siehe auch Abb. S1f, g weiter unten).

Insgesamt wurde die NSE-Aktivierung durch SSOs, die den Zugang zu NSE-Spleißstellen blockieren und die RNase-H-Spaltung nicht unterstützen, effizient gehemmt. Das effizientere SSO rettete teilweise die NSE-vermittelte Hemmung von ATM.

Um intronische regulatorische cis-Elemente zu identifizieren, die den NSE-Einschluss in reife Transkripte steuern, nutzten wir eine zuvor berichtete AT-Mutation IVS28-159A > G13. Wir stellten fest, dass diese Mutation das NSE 3'ss aktivierte, während es dessen 5's unterdrückte und stattdessen ein nachgeschaltetes 5'ss förderte, wodurch ein kryptisches 112-nt-Exon in die mRNA eingeführt wurde13. Wir stellten auch fest, dass es innerhalb dieses Exons einen starken 3′ss-Konsens gab, dem optimale BPS/PPT-Motive vorausgingen, die möglicherweise U2AF binden und ein kleineres 24-nt-Pseudoexon aktivieren (genannt PE; Abb. 4a). Die Untersuchung veröffentlichter RNA-Vernetzungs-/Immunpräzipitationsdaten20 in ATM zeigte, dass U2AF65 stromaufwärts und stromabwärts von NSE und stromaufwärts von PE bindet, was darauf hindeutet, dass die NSE-Aktivierung durch die Konkurrenz zwischen teilweise produktiven Spleißosomen, die sich an der PE 3′ss und der NSE 3′ss zusammensetzen, gesteuert werden könnte. Die beiden 3′s sind bei Säugetieren konserviert und durch einen Abstand voneinander getrennt, der kleiner als die minimale Introngröße ist, was sterisch die gleichzeitige Erkennung von NSE und PE verhindert (Abb. 4a). Die Löschung des im C-Minigen eingeführten PE-PPT/3′ss, die die NSE-Repression durch verminderte U2AF-Bindung an PE mildern sollte, erhöhte den NSE-Einschluss (Abb. 4b) in Übereinstimmung mit der 3′ss-Konkurrenz. Diese Deletion führte auch zur Retention des Introns, das NSE und PE trennt, und ahmte das Spleißmuster der AT-Mutation IVS28-159A >G nach. Die Erhöhung der Intronlänge von 59 auf 79 nt und damit die Überwindung einer sterischen Behinderung durch den unzureichenden Abstand zwischen den beiden Pseudo-3′s verbesserte auch den NSE-Einschluss und verringerte die Intronretention (Abb. 4b).

Identifizierung intronischer cis-Elemente und SSOs, die die NSE-Aktivierung modulieren. (a) Schematische Darstellung zweier Pseudoexons im ATM-Intron 28. Kanonische Exons, NSE und PE werden als graue, weiße bzw. karierte Kästchen dargestellt. Das Sternchen gibt den Ort der IVS28-159A >G-Substitution an13. In diesem AT-Fall waren sowohl NSE als auch PE zusammen mit der dazwischen liegenden Sequenz in der ATM-mRNA enthalten. Kanonische und abweichende Transkripte werden durch gepunktete Linien oberhalb und unterhalb der Prä-mRNA gekennzeichnet. Das mittlere Feld zeigt die RNA-Seq-Lesedichten für NSE in Zellen, denen beide U2AF35-Isoformen (ab-) entzogen sind, zusammen mit U2AF65-Tags/hochsicheren Bindungsstellen (horizontale Linien/Rechtecke), die durch Vernetzung und Immunpräzipitation identifiziert wurden20. Der 100-basige Wirbeltierschutz von Phylop (100 VC) befindet sich ganz unten. Das untere Feld zeigt Mutationen (in Rot und unterstrichen), die in das C-Minigen eingeführt wurden. (b) Spleißmuster von Wildtyp- und mutierten C-Minigenen. Mutationen befinden sich am unteren Rand von Panel (a); RNA-Produkte sind rechts schematisch dargestellt. Das größte vom Klon PE delPPT/AG produzierte Produkt umfasst das verkürzte Pseudointron. (c) Spleißmuster von C-Minigenen, die in NSE (Spuren 2, 3, 7 und 8) oder PE (Spuren 4, 5, 9 und 10) in (schein)-abgereicherten HEK293-Zellen mutiert sind. Mutationen liegen ganz unten; ihre Sequenzen sind in Tabelle S2 aufgeführt. Gespleißte Produkte sind rechts schematisch dargestellt. Ein Haarnadelsymbol über PE kennzeichnet die MIR-Stamm-Schleifen-Insertion; cr3'ss, eine kryptische 3er-Aktivierung 7 nt stromabwärts des authentischen NSE 3'ss. (d, e) SSO-induzierter Pseudoexon-Wechsel. Transfizierte Minigene werden oben angezeigt, gespleißte Produkte rechts und SSOs unten. SSO-Sequenzen sind in Tabelle S1 aufgeführt. Die in den Panels (d–g) gezeigte Endkonzentration der SSOs betrug 3, 10 und 30 nM. (f) PE-SSOs führten zum Überspringen von NSE. (g) SSOs, die auf eine Sequenz abzielen, die NSE bei Löschung aktiviert (PEdelPPT/AG; Panel a und b), hemmen PE. (h) Die NSE-Aktivierung ist Haplotyp-abhängig. Die Minigen-Haplotypen der angegebenen Varianten sind unten aufgeführt. Die Spalten stellen den mittleren NSE-Einschluss dar, Fehlerbalken sind SDs, Sternchen kennzeichnen statistisch signifikante Unterschiede wie in Abb. 1b.

Um zu testen, ob NSE den PE-Einschluss in der mRNA beeinflussen kann, haben wir zunächst die NSE 3′ss eliminiert. Die NSE 3′ss-Mutation aktivierte einen kryptischen 3′ss 7-nt stromabwärts, der einen geringeren Bedarf an U2AF hatte (Abb. 4c, Spuren 1, 2 und 6, 7, Tabelle S2). Da die Verlängerung des Introns zwischen NSE und PE vor diesem Hintergrund auch PE nicht aktivierte (Spuren 3 und 8) und PE keine exonischen Spleißverstärker aufweist und ein suboptimales BPS aufweist (Tabelle S3), haben wir einen 24-nt-Stemloop eingefügt, der von einem Säugetier stammt -breite eingestreute Wiederholung (MIR) in der Mitte von PE. Diese MIR-Haarnadel fungiert durch einen freiliegenden Spleißverstärker in einer terminalen RNA-Triloop21 als nahezu universelles Exon-Definitionsmodul. Das vergrößerte PE war in scheindepletierten Zellen stark aktiviert, wurde jedoch in Zellen ohne U2AF35 (Spuren 4 und 9) durch NSE verdrängt, was unterschiedliche Anforderungen der beiden Pseudoexons an U2AF(35) zeigt. Das Konstrukt, das sowohl die MIR-Insertion in PE als auch das verlängerte Intron enthielt, erzeugte schließlich mRNAs, die sowohl NSE als auch PE enthielten (Spuren 5 und 10).

Als nächstes haben wir diesen MIR-Reporter eingesetzt, um die Auswirkungen von NSE- und PE-SSOs auf die Exon-Nutzung und die ATM-Expression zu testen. Abbildung 4d zeigt, dass das NSE 3′ss SSO Transkripte mit NSE unterdrückte und diejenigen mit PE hochregulierte, wohingegen der gegenteilige Effekt für SSOs festgestellt wurde, die auf die MIR-Enhancer-Schleife in PE abzielen. Wir beobachteten das gleiche Muster für den Reporter, bei dem NSE und PE durch einen Abstand voneinander getrennt waren, der für ihren gleichzeitigen Einbau in die mRNA nicht ausreichte (Abb. 4e). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass SSOs, die auf PE- und/oder U2AF65-Bindungsstellen stromaufwärts von PE abzielen, möglicherweise die NSE-Inklusion fördern und die ATM-Expression verringern können, wodurch die NSE-SSOs aufgehoben werden. Dieser Ansatz könnte eine umfassendere Strategie für intronische SSOs bieten, um die Genexpression in beide Richtungen zu modulieren, indem sie auf konkurrierende Pseudoexons abzielen, von denen eines für die Genregulation entscheidend ist. Um dieses Konzept zu testen, haben wir PE-SSOs untersucht. Obwohl SSOs, die auf PE-Spleißstellen abzielen, das Überspringen von NSE in exogenen und endogenen Transkripten induzierten (Abb. 4f), blockierten SSOs den Zugang zu U2AF65-Bindungsstellen direkt stromaufwärts von PE (Abb. 4a), d. h. auf das NSE-reprimierende Motiv, das im Konstrukt delPPT/AG identifiziert wurde (Abb. 4b), verringerte PE-Einschluss und leicht erhöhtes NSE im MIR-Reporter (Abb. 4g). Ein längeres Oligo, das sich in 5'-Richtung erstreckt (SSO-PEBP, Tabelle S1), veränderte die NSE-Einschlussniveaus nicht.

PE enthält eine natürliche G/A-Variante rs4988000, die auch die NSE-Erkennung beeinflussen kann (Abb. 4h). Transfektionen von C- und T-Minigenen, die bei rs4988000 systematisch mutiert waren, ergaben, dass das seltene A-Allel bei rs4988000 den NSE-Einschluss auf jeder Prä-mRNA verringerte, sowohl in U2AF35- als auch in scheindepletierten Zellen. Somit wurde die höchste NSE-Inklusion durch den häufigsten Haplotyp bei Kaukasiern (CG) erzeugt, gefolgt von den Haplotypen CA > TG > TA.

Insgesamt kann die Haplotyp-abhängige Aktivierung des U2AF-reprimierten NSE durch SSOs modifiziert werden, die auf regulatorische Spleißmotive konkurrierender Pseudo-3′s abzielen.

Da ATM eine wichtige apikale Kinase im DDR-Signalweg22 ist und durch U2AF veränderte NMD-Switch-Exons häufig in Genen vorkamen, die für U2AF-Protein-Interaktionspartner kodieren11, haben wir systematisch U2AF(35)-induzierte RNA-Verarbeitungsänderungen derzeit bekannter ATM-Substrate23 und anderer Bestandteile charakterisiert ATM-Signalisierungsnetzwerk24. Obwohl an der DDR- und Zellzykluskontrolle beteiligte Gene, die U2AF(35)-abhängige Exons enthielten, nur geringfügig angereichert waren (FDR = 0,08)11, zeigte interessanterweise jede Komponente in der ATM-CHEK2-CDC25-CDC2/Cyclin-B-Achse eine RNA-Verarbeitung Änderungen (Abb. 5a, Abb. S2). Dieser Pfad ist für die ATM-Signalisierung von DSBs22 von entscheidender Bedeutung.

Exonzentrische Regulierung der ATM-Signalisierung. (a) U2AF-regulierte Expressionsänderungen auf Gen- und Exon-Ebene im MRN-ATM-CHEK2-CDC25-cdc2/Cyclin B-Signalweg (linkes Feld). Log2fold- und q-Werte63 werden in Klammern angezeigt. Die Exon-Nutzung der CHEK2- und CDC25A-Gene wird durch RNA-Seq-Browseraufnahmen gezeigt; PCR-Validierungsgele befinden sich in den richtigen Feldern. CHEK2-Exon 9 ist ein NMD-Switch-Exon; Exon 11 kodiert einen Teil der Kinasedomäne. Das gesamte Spektrum der U2AF-vermittelten Expressionsänderungen im ATM-Signalweg ist in Abb. S2 dargestellt. Beispiele für die U2AF-vermittelte Spleißregulation finden Sie in den Abbildungen S3–S6. (b) Beeinträchtigte ATM-Signalisierung in U2AF35-depletierten Zellen nach IR. HEK293-Zellen wurden (scheinbar) von U2AF35 befreit und 48 Stunden später IR (10 Gy) ausgesetzt. Die Expression wurde durch Immunblotting zu den angegebenen Zeitpunkten untersucht. Antikörper werden rechts angezeigt. Die CHEK2-Exon-9-Skipping-Level liegen unten; Ihre Messungen in Kontrollzellen (U2AF35+) und abgereicherten Zellen (U2AF35−) sind in Tafel (c) dargestellt. (d) CHEK2-Exon-9-Einschluss in UPF1-abgereicherte Zellen. Die Endkonzentration der UPF1-siRNA (Tabelle S1) betrug 12,5, 25, 50 und 100 nM. (e) Die Unterdrückung von CHEK2-Exon 9 durch SSO verringerte die CHEK2-Spiegel und förderte den NSE-Einschluss. Die Endkonzentration von SSO, das auf CHEK2-Exon 9 zielte, betrug 3, 10 und 30 nM. (f) CHEK2-Exon-9-Einschluss bei der Transfektion von HEK293-Zellen mit den angegebenen SSOs. (g) Ein Mangel an SF3B1 induzierte das Überspringen von CHEK2-Exon 9, veränderte jedoch nicht die NSE-Aktivierung. Die Endkonzentration jeder auf SF3B1 gerichteten siRNA betrug 20 nM.

Erstens war eine verringerte ATM-Expression in Zellen ohne U2AF (Abb. S1e) mit einer verminderten CHEK2-mRNA, einer erhöhten Retention des CHEK2-Introns 10 und dem Überspringen der Exons 9 und 11 verbunden (Abb. 5a). Veränderungen der RNA-Verarbeitung bekannter CHEK2-Substrate beschränkten sich auf Gene, die den Zellzyklus regulieren (CDC25A, CDC25B, CDC25C und TTK; Abb. 5a, S3a, b, S4a) und waren in Genen, die an der DNA-Reparatur beteiligt sind (BRCA1/2, XRCC1), nicht erkennbar , FOXM1, TRIM28) oder p53-Signalisierung (TP53, MDM4, CABIN1, STRAP, AATF). Das CHEK2-Exon-9-Skipping, von dem erwartet wird, dass es NMD aktiviert, war 24 Stunden nach IR nur geringfügig erhöht und schien nicht zum Rückgang des gesamten CHEK2 beizutragen, der bereits 30 Minuten nach IR beobachtet wurde (Abb. 5b, c). Da der Einschluss von CHEK2-Exon 9 nur für die höchste Konzentration der getesteten UPF1-siRNAs erhöht war (Abb. 5d), transfizierten wir HEK293-Zellen mit einem SSO, das auf seine 3′s abzielte. Diese Behandlung führte zum Überspringen von Exon 9 und verringerte die Expression des CHEK2-Proteins (Abb. 5e). SSOs, die auf NSE oder PE abzielten, hatten keinen Einfluss auf den Einschluss von CHEK2 Exon 9 (Abb. 5f). Das Überspringen von Exon 9, jedoch nicht von NSE, war in Zellen ohne SF3B1 dramatisch erhöht (Abb. 5g). Um herauszufinden, warum die exogene Expression von CHEK2 in Zellen ohne U2AF35 im Vergleich zu Kontrollen erhöht war (Abb. S1e), haben wir HEK293-Zellen mit dem CHEK2-reprimierenden SSO und einem CHEK2-exprimierenden Plasmid cotransfiziert (Abb. S1f, g). Reduziertes endogenes CHEK2 war auch in U2AF-fähigen Zellen mit einem signifikanten Anstieg von exogenem CHEK2 verbunden, was auf eine strenge homöostatische Regulierung des gesamten CHEK2-Proteins in der Zelle hinweist.

Zweitens war U2AF für die vollständige Aktivierung des CDC25A-Exons 6 (Abb. 5a) erforderlich, das für einen durch CHEK2/CHEK1 phosphorylierten Serinrest (S178) kodiert. U2AF(35) war auch für den Einschluss von Exon 3 von CDC25B und CDC25C erforderlich (Abb. S3a, b), was die Microarray-Daten bestätigte. CDC25B-Exon 3 kodiert für mehrere phosphorylierte Reste, einschließlich S169; Die an S169 phosphorylierte Isoform lokalisiert sich in den Zentrosomen und akkumuliert während der Mitose26. CDC25C-Exon 3 kodiert für T67, das durch CDC2/Cyclin-B als Teil der Autoamplifikationsschleife27 phosphoryliert wird. Phosphoryliertes T67 in CDC25C erzeugt eine Bindungsstelle, die von der WW-Domäne von PIN127 erkannt wird, was die Aktivierung eines weiteren U2AF-unterdrückten NMD-Switch-Exons aufrechterhält (Abb. S4b) und möglicherweise die katalytische Aktivität dieser reichlich vorhandenen Peptidyl-Prolyl-Isomerase verändert. Schließlich wurden Cyclin B1- und B2-mRNAs in Zellen ohne U2AF35 und ohne Cyclin B1-interagierendes Protein (CCNB1IP1) hochreguliert, obwohl ihre RNA-Verarbeitungsmuster nicht verändert zu sein schienen (Abb. 5a). Die Hochregulierung von Cyclin B war mit einem zurückgehaltenen CDK1-Intron verbunden (Abb. S4c), das möglicherweise posttranskriptionell gespleißt wird 14 .

Die Rekrutierung von Geldautomaten für DSB wird durch den MRN-Komplex erleichtert, der aus MRE11, RAD50 und NBN22 besteht. NBN zeigte keine offensichtlichen RNA-Verarbeitungsveränderungen in Zellen ohne U2AF35, aber RAD50-mRNA wurde herunterreguliert, möglicherweise durch Aktivierung eines NMD-Switch-Exons und/oder zusätzliche Spleißveränderungen (Abb. S5a-c und Abb. S2). Das letzte MRE11A-Exon wurde hochreguliert, möglicherweise als Folge einer Förderung der distalen alternativen Polyadenylierungsstelle in erschöpften Zellen, die in den meisten Zelltypen, jedoch nicht in B-Zellen, verwendet wird28. Die DEXSeq-Analyse ergab keine signifikanten RNA-Verarbeitungsänderungen in Transkripten, die für andere Mitglieder der Phosphatidylinositol-3-Kinase-ähnlichen Familie von Serin-/Threoninkinasen (ATR und PRKDC) kodieren, noch in BRCA1/2, RNF168 und dem ATM-Interaktor ATMIN. Zu den weiteren ATM-Interaktionspartnern mit veränderter Exon- oder Genexpression gehörten RPS6, SRSF1 und andere SR-Proteine, EP300, RPA2, BLM, FANCD2 und FANCI, PPP2R5C und PPP2R5D sowie SMC3, ein zentraler Bestandteil des Kohäsinkomplexes (Abb. S2).

Die Erschöpfung von U2AF35 war mit bevorzugten Veränderungen von Genen/Exons verbunden, die an der Chromatinmodifikation11 beteiligt sind und zahlreiche funktionelle Verbindungen zur ATM-Signalisierung aufweisen (Abb. S2)22. Beispielsweise wird der Chromatin-Remodelling-Komplex INO80 durch ATM phosphoryliert und ist funktionell mit Checkpoint-Regulatoren verbunden, darunter CHEK229. U2AF inhibierte INO80C-Isoformen mit 54-nt-Exons11, die wahrscheinlich an der Heterodimerbildung mit ACTR5 beteiligt sind. Die Depletion von U2AF35 veränderte die Expression mehrerer INO80-Komponenten, einschließlich ACTR5, ACTL6A und RUVL2B11. Viele INO80-Untereinheiten sind auch bevorzugt in Telomeren lokalisiert30. U2AF war für den vollständigen Einschluss von TERF1 Exon 7 in die mRNA erforderlich (Abb. S6a) und kontrollierte so die relative Häufigkeit der TRF1 (Exon 7+)/PIN2 (Exon 7−)-Isoformen, wichtige Komponenten des Telomer-schützenden Shelterin-Komplexes. Exon 7 kodiert für mehrere phosphorylierte Serinreste und beide Isoformen können über die Dimerisierungsdomäne heterodimerisieren31. Die Bindung von TRF1 an Telomere wird auch durch ATM-Hemmung gefördert, während ATM-vermittelte Phosphorylierung die TRF1-Wechselwirkung mit telomerer DNA32 beeinträchtigt. Die TRF1-Assoziation mit Telomeren wird auch durch RAD5032 negativ reguliert. TRF1-interagierendes TIF2, ein weiteres Shelterin-Protein, das in der Kernmatrix lokalisiert ist, existiert in mindestens zwei Isoformen, die durch alternatives Spleißen hergestellt werden und als TIN2S und TIN2L33 bezeichnet werden. TIN2L enthält eine zusätzliche NM-Bindungsdomäne und bindet stärker an die Kernmatrix als TIF2S¸, das durch ein Transkript mit erhaltenen 3‘-Introns kodiert wird, die eine lange 3‘-untranslatierte Region bilden33. Diese mRNA-Isoform wurde durch U2AF unterdrückt (Abb. S6b).

Insgesamt zeigen diese Ergebnisse, dass die MRN/ATM-CHEK2-CDC25-cdc2/Cyclin B-Achse im Zentrum der U2AF(35)-vermittelten Kontrolle von DDR steht, obwohl sich die U2AF-Regulierung auf weitere ATM-Substrate erstreckt, die hauptsächlich am Chromatin beteiligt sind Modifikation und Telomeraktivität.

CHEK2 phosphoryliert PML (Promyelozytische Leukämie) und scheint PML für die anschließende Autophosphorylierung zu benötigen34. Die Erschöpfung von U2AF35 förderte die Verwendung der proximalen alternativen Polyadenylierungsstelle von PML, was zur Hochregulierung der kürzesten PML-Isoform führte, der das letzte Exon fehlt, das für das Kernexportsignal kodiert (Abb. S7a). Die langen und kurzen PML-Isoformen haben unterschiedliche Funktionen; Beispielsweise sind nukleare PML-Isoformen, nicht jedoch die zytoplasmatische Isoform, positive Regulatoren der IFNγ-Signalübertragung35. Der C-Terminus der längsten Isoform interagiert spezifisch mit AML1, um die AML1-vermittelte Transkription zu verbessern36, was darauf hindeutet, dass ein U2AF-Mangel die PML-AML1-Interaktionen beeinträchtigen könnte. PML bindet auch PIN1 und diese Wechselwirkung fördert den PML-Abbau auf phosphorylierungsabhängige Weise37. Die U2AF-Depletion erhöhte ein PIN1-NMD-Exon (Abb. S4b), was möglicherweise die Expression dieser reichlich vorhandenen Peptidyl-Prolyl-Isomerisierung einschränkte, die mit vielen Phosphoproteinen interagiert, um die Mitose zu regulieren, einschließlich phosphoryliertem CDC2538. Abgesehen von PML führte die Depletion von U2AF35 zu einer Hochregulierung anderer RARA-Partner, einschließlich NPM1 (Abb. S7b). Dieses Ereignis war mit der Förderung einer proximalen Polyadenylierungsstelle verbunden und erhöhte die Häufigkeit kürzerer Transkripte. Ein alternativ gespleißtes Exon von BCOR, einem BCL6-Corepressor, der BCOR-RARA-Fusionen39 bildet und mit mehreren Histondeacetylasen interagiert, um die BCL6-Transkriptionsrepression zu erhöhen40, wurde ebenfalls herunterreguliert (Abb. S7c).

Interessanterweise war die Überlappung zwischen U2AF35-empfindlichen Genen/Exons und 1.187 Genen, die an krebsassoziierten Genfusionen beteiligt sind,41 und 300 Genen, die an wiederkehrenden Chromosomentranslokationen beteiligt sind,42 größer als erwartet, wobei signifikantere P-Werte für Gene mit unterschiedlich verwendeten Exons auftraten als diejenigen, die dadurch impliziert werden Manschettenknopf-Algorithmus (Tabelle 1). In ähnlicher Weise war die gemeinsame Nutzung von Genen, die beim myelodysplastischen Syndrom häufig mutierten43 und von Genen, die bei U2AF35-Depletion unterschiedlich exprimiert wurden,11 signifikant höher als erwartet (P <0,01, hypergeometrischer Test). Daher wird die RNA-Verarbeitung von Transkripten, die an krebsassoziierten Genfusionen und Chromosomentranslokationen beteiligt sind, bevorzugt durch U2AF reguliert.

Um die Funktion krebsassoziierter U2AF1-Mutationen beim NSE-Spleißen zu testen, führten wir Rekonstitutionsexperimente mit Wildtyp- und mutierten U2AF35-Konstrukten durch, die mit dem C-Minigen in Zellen, denen U2AF35 (scheinbar) entzogen war, cotransfiziert wurden (Abb. 6). Die NSE-Aktivierung wurde durch beide U2AF35-Isoformen in ähnlichem Ausmaß unterdrückt, ebenso wie durch U2AF35a, das krebsassoziierte Substitutionen von S34 in der Zinkfinger-1-Domäne enthielt, dem am häufigsten mutierten U2AF35-Rest bei Krebs7. Im Gegensatz dazu wurde durch Substitutionen von Q157 in der zweiten Zinkfingerdomäne, wo diese Mutationen weniger häufig sind, nur eine teilweise Rettung erreicht. Andere S34-Mutationen konnten den Defekt nicht vollständig wiederherstellen, einschließlich S34T und Substitutionen mit kleinen Aminosäuren, obwohl ein großer Rest an dieser Position (S34R) effizient war, was darauf hindeutet, dass die Größe dieses Rests für die Ligandenbindung entscheidend ist. Daher war die Identität des Rests an Position 34 von U2AF35 wichtig für die NSE-Erkennung.

Rettung der NSE-Repression durch krebsassoziierte Mutationen in U2AF35. Rettung des U2AF(35)-abhängigen NSE-Spleißens des C-Minigens durch Zinkfinger-1- und 2-Substitutionen in U2AF35 (oberes Feld). Alle Substitutionen erfolgten im U2AF1a-Konstrukt (35a)11. Krebsassoziierte Mutationen (unten) sind eingerahmt; Spleißprodukte befinden sich rechts. Fehlerbalken sind SDs von 2 Transfektionen. Im unteren Bereich ist ein Immunoblot mit U2AF35- und GFP-Antikörpern dargestellt. ex, exogen; de, endogenes U2AF35.

Schließlich stellten wir einen geringen Grad an NSE-Aktivierung in verschiedenen menschlichen Geweben fest, sowohl in Hexamer-primierten Proben als auch in polyadenylierten Transkripten (Abb. S8a). Der Anteil NSE-haltiger RNAs war in Leukämiezellen im Durchschnitt höher als in normalen Zellen, wobei einige Proben sehr hohe Werte aufwiesen (Abb. S8b, c), was möglicherweise zu einer verringerten ATM-Expression in Krebszellen beitrug. Wir untersuchten auch den NSE-Einschluss in polyadenylierten RNAs, die aus einer Reihe lymphoblastoider Zelllinien extrahiert wurden, die vor der Lyse bei den angegebenen Temperaturen Kälte- und Hitzeschock ausgesetzt waren (Abb. S8d, e). Interessanterweise wurde NSE in geringem Maße aktiviert, indem die Zellen 42 °C ausgesetzt wurden, jedoch nicht bei subphysiologischen Temperaturen (Abb. S8d), was darauf hindeutet, dass deutlich höhere NSE-Einschlusswerte in bösartigen Zellen wahrscheinlich nicht durch einen Kälteschock während der Lagerung erklärt werden können Patientenproben. Da die proteomische Profilierung von Jurkat-Zellen, die Hitzestress bei 43 °C ausgesetzt waren, eine verminderte Expression mehrerer Proteine, einschließlich U2AF35a44, ergab, stützen diese Ergebnisse U2AF35 als spezifischen NSE-Repressor.

Hier haben wir ein alternatives spleißgekoppeltes NMD-Switch-Exon identifiziert, das für die ATM-Expression entscheidend ist (Abb. 1 und 3) und dessen Bedeutung für das Krebsrisiko untersucht (Abb. 2, Abb. 6 und S8). Wir haben auch gezeigt, wie der Einschluss dieses Exons in reife Transkripte durch intronische Haplotypen und RNA-bindende Proteine ​​beeinflusst wird, die an der 3′ss-Selektion beteiligt sind (Abb. 2 und 4h). Schließlich haben wir SSOs identifiziert, die die Aktivierung dieses Exons modulieren, indem sie auf seine regulatorischen Sequenzen abzielen, und eine neuartige Antisense-Strategie zur Modifizierung der Genexpression vorgeschlagen. Diese Ergebnisse erweitern die derzeit bekannten Zusammenhänge zwischen RNA-Verarbeitung und DDR-Signalwegen erheblich (Abb. 5 und S2).

U2AF-reprimierte Exons weisen im Vergleich zu U2AF-aktivierten Exons eine ausgeprägte 3′ss-Organisation und Reaktion auf U2AF-verwandte Proteine ​​auf11, was darauf hindeutet, dass die NSE-Repression eine direkte RNA-Bindung beinhaltet. Dies wird durch die beobachtete NSE-Aktivierung bei exogenen Transkripten, die keiner NMD unterliegen, und durch die SSO-induzierte NSE-Blockade gestützt (Abb. 2 und 4). NSE fehlen AG-Dinukleotide zwischen dem vorhergesagten BPS und 3′ss, seine AG-Ausschlusszone ist länger als der Durchschnitt und weist einen ungewöhnlichen Abschnitt von 5 konservierten Guaninen stromaufwärts des BPS auf, was möglicherweise zu stabilen Sekundärstrukturen über 3′ss hinweg beiträgt für die Hemmung erforderlich. Die adeninreichen 3'-Teile von NSE und PE sind in der Evolution stärker konserviert als ihre 5'-Teile (Abb. 4a) und ermöglichen möglicherweise wichtige Ligandenwechselwirkungen, da Adenin dazu neigt, ungepaarte Positionen in strukturierten RNAs einzunehmen. Obwohl die direkte RNA-Bindung die einfachste Erklärung für die Exon-Repression durch U2AF zu sein scheint, führte die Depletion von U2AF35 zur Herunterregulierung mehrerer an NMD beteiligter Proteine ​​(Tabelle S4), was möglicherweise zur NSE-Aktivierung auf endogenen Transkripten beiträgt. Physische Wechselwirkungen zwischen U2AF65 und dem C-Terminus von TRF145 oder anderen Komponenten des ATM-Signalisierungsnetzwerks46 könnten ebenfalls an der NSE-Regulierung beteiligt sein. Eine Herausforderung für die Zukunft wird darin bestehen, Einblicke in die Mechanismen der NSE-Repression in normalen Zellen und Krebszellen zu gewinnen, bei denen die NSE-Kontrolle beeinträchtigt zu sein scheint, was möglicherweise die ATM-Expression und DDR in haplotypabhängiger Weise verändert (Abb. 2 und S8b, c).

Abgesehen von U2AF1/U2AF2 wurde festgestellt, dass weitere Gene, die an der 3′s-Selektion beteiligt sind, bei Krebs mutiert sind7. Interessanterweise waren chronische lymphatische Leukämien mit SF3B1-Mutation mit einer kryptischen 3′ss-Aktivierung des ATM-Exons 46 verbunden, was zu einer ATM-Verkürzung führte . Das Spleißen eines EZH2-Exons als Folge einer krebsassoziierten SRSF2-Mutation war mit einer beeinträchtigten hämatopoetischen Differenzierung verbunden48 und das gleiche NMD-Exon war auch in Zellen ohne U2AF35 hochreguliert (Abb. S5d). Ob diese Exons Ziele eines gemeinsamen 3′ss-Erkennungswegs sind, der der Leukämogenese zugrunde liegt, muss noch geklärt werden.

Da die NSE-Aktivierung die ATM-Expression sowohl in normalen als auch in Krebszellen einschränken kann (Abb. 1, 2 und S8) und ATM ein limitierender Faktor im DDR-Signalweg ist22, kann Cytosin bei rs609261 auch in der Keimbahn zu einem relativen ATM-Mangel führen. Die Aktivität der ATM-Kinase scheint ein guter Prädiktor für den AT-Schweregrad zu sein. Die Diversität der AT-Allele erklärt jedoch nicht vollständig das Spektrum der klinischen Symptome, was für die Rolle zusätzlicher Faktoren spricht49. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass Gene, die an der NSE-Aktivierung beteiligt sind, und natürliche Varianten, die den NSE-Einschluss modulieren (Abb. 1, 2c–f und 4h), die phänotypische Komplexität von AT und auch AT-Heterozygoten verändern könnten, denen offensichtliche klinische Merkmale fehlen, die aber möglicherweise eine erhöhte Strahlenempfindlichkeit und ein erhöhtes Krebsrisiko aufweisen50, dh. Phänotypen, die durch den kritischen U2AF-regulierten Signalweg im ATM-Signalisierungsnetzwerk beeinflusst werden (Abb. S2). Obwohl die SSO-induzierte Unterdrückung endogener NSE-Transkripte auch in unbehandelten Zellen beobachtet wurde (Abb. 3b) und NMD-Transkripte mit einer relativen Häufigkeit von nur ~ 1 % dramatisch zum mRNA-Verbrauch beitragen können, muss noch geprüft werden, ob sie reduziert werden kann zu einem nachhaltigen Anstieg des ATM-Proteinspiegels führen. Dieser Ansatz könnte das Potenzial haben, phänotypische Folgen von undichten AT-Allelen mutationsunabhängig zu lindern, insbesondere bei Patienten, die das C-Allel bei rs609261 tragen.

Unsere Ergebnisse zeigen auch, dass die NSE-Aktivierung bei Kaukasiern im Durchschnitt effizienter ist als bei asiatischen Populationen, was auf die höhere Häufigkeit des C-Allels bei rs609261 in ersteren zurückzuführen ist (Abb. 2). Diese unterschiedliche NSE-Kontrolle kann möglicherweise dazu beitragen, dass die Sterblichkeitsraten für häufige bösartige Erkrankungen in asiatischen Bevölkerungsgruppen dauerhaft niedriger sind als bei Kaukasiern52,53. rs609261 liegt nur etwa 35 kb stromabwärts von rs2235006, das sich in einer Region mit minimaler meiotischer Rekombination befindet54 und mit einem hohen Risiko (OR 11,2) für chronische lymphatische Leukämie55 verbunden war. Diese Studie genotypisierte 1467 kodierende nicht-synonyme SNPs in 865 Kandidatengenen und implizierte Varianten in Genen, die die ATM-BRCA2-CHEK2-DDR-Achse als den bedeutendsten Risikopfad kodieren. Bei asiatischen Krebspatienten wurde außerdem eine geringere Prävalenz einiger Genfusionen festgestellt als bei Kaukasiern56, was möglicherweise auf ihre Fähigkeit zurückzuführen ist, auf DSBs zu reagieren.

Unsere Studie verdeutlicht auch die aktuellen Einschränkungen unvollständiger Transkriptannotationen und die Bedeutung der Untersuchung kryptischer Exons in RNA-Seq-Daten. Obwohl RNA-Seq ein leistungsstarkes Werkzeug zur Untersuchung des globalen Transkriptoms ist, müssen noch strenge Standards implementiert werden, die die biologische und statistische Signifikanz der beobachteten Veränderungen in der RNA-Verarbeitung korrekt bewerten. Angesichts der hohen Stringenz des standardmäßigen DEXSeq-Algorithmus11,57 können wir die Existenz zusätzlicher biologisch wichtiger RNA-Verarbeitungsereignisse, die durch U2AF reguliert werden, nicht ausschließen. Beispielsweise würde die Förderung einer proximalen Polyadenylierungsstelle in CHEK1 in erschöpften Zellen in Verbindung mit der Hochregulierung von 24-nt- und 27-nt-Exons in CLASP1, Ereignisse, die in genomischen Browsern beobachtet wurden, den ATM-Apoptoseweg implizieren. Dieser Signalweg ist von besonderem Interesse beim myelodysplastischen Syndrom, bei dem myeloische Vorläufer anfällig für den programmierten Zelltod sind, Mutationen in 3′ss-Erkennungsgenen besonders häufig vorkommen7 und eine Deregulierung von Genen, die an der ATM-Signalübertragung beteiligt sind, mit fortgeschritteneren klinischen Stadien verbunden ist58. Interessanterweise wurde festgestellt, dass U2AF1-Mutationen in späteren Stadien häufiger auftraten und mit kürzeren Überlebenszeiten verbunden waren59.

Schließlich zeigt unsere Arbeit eine effiziente Unterdrückung eines kritischen NMD-Switch-Exons in ATM durch SSOs, die auf regulatorische Motive konkurrierender Pseudoexons abzielen und in der Lage sind, die ATM-Proteinspiegel zu erhöhen (Abb. 3a–d, 4 und S1). Die vorgeschlagene Strategie kann mit Genombearbeitung wie CRISPR-Cas9 kombiniert werden, um regulatorische Spleißmotive oder Proteinbindungsstellen in Introns zu verändern, und sollte uns auch dabei helfen, effiziente intronische SSOs mit den gewünschten Ergebnissen für die RNA-Verarbeitung zu finden. Die Suche nach solchen SSOs ist anspruchsvoller als nach solchen, die auf menschliche Exons abzielen. Beispielsweise stimulierten die meisten SSOs, die SMN2-Exon 7 systematisch abdeckten, das Exon-Skipping, das für die Antisense-Therapie der spinalen Muskelatrophie erforderlich ist, führten jedoch zu einem um etwa 20 % erhöhten Exon-Einschluss60. Im Gegensatz dazu wurde eine Stimulation des Intronspleißens nur bei etwa 10 % der SSOs gefunden, die auf das INS-Intron 1 abzielten, während die Mehrheit diesen Effekt nicht zeigte61. Die Vielseitigkeit intronischer oder exonischer SSOs zur Modulation des Spleißens in beide Richtungen nutzt einen viel höheren Informationsgehalt der Hilfsspleißsequenzen beim Menschen im Vergleich zu niederen Organismen. Zukünftige SSO-Designstrategien sollten daher durch globale Studien zur prä-mRNA-Faltung, RNA-Vernetzung und Immunpräzipitation erheblich erleichtert werden. Im Gegensatz zum SSO, das die NSE-3′ss effizient blockierte (SSO-NSE3, Abb. 3a, b), gelang es einem teilweise überlappenden Morpholino, das sich nur 7-nt in NSE erstreckte, nicht, dasselbe 3′ss zu unterdrücken, um das Spleißen der Mutation zu retten IVS28-159A>G62, obwohl auf U2AF-Bindungsstellen abgezielt (Abb. 4a). Dies deutet darauf hin, dass das Morpholino den Zugang zu Strukturen oder Motiven blockiert, die nicht für die Exon-Aktivierung, sondern für die Exon-Repression verantwortlich sind, was mit unserem Befund übereinstimmt (Abb. 1a – c). Daher könnte die Verabreichung von Antisense-basierten RNA-Prozessierungsaktivatoren oder -inhibitoren, die auf Bindungsstellen von Spleißfaktoren in Introns abzielen oder diese vermeiden, therapeutisch genutzt werden, um positive oder schädliche Folgen von NMD in Krebszellen zu beeinflussen.

ATM-Minigene wurden durch Klonieren von ~0,9-kb-Amplifikaten in XhoI/XbaI-Stellen des zuvor beschriebenen U2AF1-Konstrukts hergestellt11. Klonierungsprimer sind in Tabelle S1 aufgeführt. Vollständige Inserts wurden sequenziert, um die Identität der beabsichtigten Änderungen zu bestätigen und unerwünschte Mutationen auszuschließen. Der PUF60-Expressionsvektor wurde zuvor beschrieben11. Das hnRNP-A1-Konstrukt war eine großzügige Schenkung von Gideon Dreyfuss (University of Pennsylvania).

Zellkulturen wurden unter Standardbedingungen in DMEM, ergänzt mit 10 % (v/v) Rinderkalbsserum (LifeTechnologies), gehalten. Die Abreicherung von U2AF-Untereinheiten und U2AF35-Isoformen mit kleinen interferierenden RNAs (siRNAs) und splice-switching Oligonukleotiden (SSOs) wurde im Anschluss an ein Zeitverlaufsexperiment durchgeführt, bei dem die Abreicherungsniveaus jeder Isoform ermittelt wurden, wie beschrieben11. Alle Oligo(ribo)nukleotide sind in Tabelle S1 aufgeführt. Die Transfektionen wurden in 6- oder 12-Well-Platten mit jetPRIME (Polyplus) gemäß den Empfehlungen des Herstellers durchgeführt, wie im Detail beschrieben11. Die Zellen wurden 48 Stunden nach dem zweiten Treffer geerntet, mit Ausnahme derjenigen, die IR ausgesetzt waren und einen einzigen Treffer erhielten. Zur SF3B1-Depletion wurden HEK293-Zellen einer siRNAs-Mischung (S23850, S23852, S223598, LifeTechnologies) ausgesetzt und 48 Stunden später geerntet.

Die Analyse der differenziellen Exon-Nutzung wurde mit DEXSeq (v. 1.12.1)57 durchgeführt, basierend auf q-Werten unter 0,05, wie ausführlich beschrieben11. Die unterschiedliche Gen- und Isoformenexpression zwischen replizierten Probensätzen wurde mit Cufflinks (v. 2.1.1)63 analysiert, das die Lesevorgänge mithilfe eines Fragmente pro Kilobase-Exon-Modells pro Million Lesevorgänge normalisiert. Die Auswahl signifikant unterschiedlich exprimierter Gene erfolgte auf der Grundlage von FDR-bereinigten P-Werten (q <0,05). Zellen, RNA-Extraktion und Bibliotheksvorbereitung erfolgten wie zuvor beschrieben11.

Das FirstChoice-Panel zur Untersuchung menschlicher Gesamt-RNA, das Gesamt-RNA-Proben aus 19 verschiedenen Geweben enthält, wurde von LifeTechnologies erworben. Jede Gewebeprobe enthielt einen Pool von RNAs verschiedener Spender. Lymphoblastoide Zelllinien, die Kälte- und Hitzeschock ausgesetzt waren, wurden bereits beschrieben64. Gesamt-RNA-Proben wurden mit der Reverse Transkriptase des Moloney-Maus-Leukämievirus (Promega) und zufälligen Hexamer- oder Oligo-d(T)-Primern revers transkribiert. cDNA-Proben wurden mit den in Tabelle S1 gezeigten Primern amplifiziert. Die aus Leukozyten von Knochenmarksproben zufällig ausgewählter Patienten mit akuter myeloischer Leukämie oder chronischer myelomonozytischer Leukämie extrahierte Gesamt-RNA wurde mit zufälligen Hexamer-Primern revers transkribiert. Die Studie wurde vom National Research Ethics Service (UK) Committee South West genehmigt.

SSOs wurden entwickelt, um die Interaktionen mit einzelsträngigen Regionen21 zu maximieren und die von Mfold65 vorhergesagten Sekundärstrukturen zu vermeiden. Alle SSOs wurden von Eurofins gekauft, in Wasser verdünnt und ihre Aliquots wurden bei –80 ° C gelagert. Ihre Sequenzen sind in Tabelle S1 aufgeführt. Alle Transfektionen wurden mit jetPRIME (Polyplus) gemäß den Empfehlungen des Herstellers durchgeführt.

(Schein)-abgereicherte HEK293-Zellen wurden 48 Stunden nach dem ersten Treffer mit einem Orthovolt-Röntgensystem D3225 von Gulmay Medical (X-Strahl) bei einer Dosisrate von 0,63 Gy min−1 bei Raumtemperatur IR ausgesetzt. Die tatsächliche Dosisleistung wurde mit einem Konstanzmessgerät überwacht. Die Zellen wurden wie in den Legenden der Abbildungen angegeben geerntet.

Die Vorbereitung der Zelllysate und das Immunoblotting erfolgten wie beschrieben11. Antikörper gegen ATM (D2E2), ATM-pS1981 (D6H9), CHEK2 (D9C6) und CHEK2pThr68 (C13C1) wurden von Cell Signaling Technology, Inc. bezogen. RBM39 (CAPERa)-Antikörper wurden von Thermo Fisher Scientific (PA5-31103) bezogen. Die Antikörper zum Nachweis von X-press tag, U2AF35, U2AF65 und Tubulin waren wie zuvor beschrieben11. SF3B1- und FUBP1-Immunoblotting wurde mit Anti-SAP155- (D138-3, MBL) bzw. Anti-FBP-Antikörpern (GTX104579, GeneTex) durchgeführt. Die Intensität des ATM-Signals wurde durch Densitometrie unter Verwendung von ChemiDoc XRS (BioRad) und seriellen Verdünnungen gepoolter Lysate auf SDS-PAGE gemessen, um den linearen dynamischen Bereich der Proteinbeladung zu bestimmen. Das densitometrische Signal wurde auf das gesamte im Blot übertragene Protein normalisiert (Abb. S1a, b), da die Depletion von U2AF35 die Expression von Hunderten von Exons verändert, viele davon in Housekeeping-Genen11.

Zitierweise für diesen Artikel: Kralovicova, J. et al. Die exonzentrische Regulierung der ATM-Expression ist bevölkerungsabhängig und kann durch Pseudoexon-Targeting antisense-modifiziert werden. Wissenschaft. Rep. 6, 18741; doi: 10.1038/srep18741 (2016).

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Wir danken Malcolm Taylor (Universität Birmingham) und Ian Eperon (Universität Leicester) für die kritische Lektüre des Manuskripts. Wir danken auch Ian Mockridge und Marta Larrayoz Ilundain (University of Southampton) für technische Hilfe. Wir danken Gideon Dreyfuss (Pennsylvania University), Adrian Krainer (Cold Spring Harbor Laboratory), Steven Marsh (UCL), Christopher Smith (University of Cambridge) und Jonathan Strefford (University of Southampton) für großzügige Reagenzienspenden. Diese Arbeit wurde durch das Leukemia and Lymphoma Research Grant 12060 an IV und NCPC unterstützt. Die Geldgeber spielten keine Rolle beim Studiendesign, der Datenerfassung und -analyse, der Entscheidung zur Veröffentlichung oder der Erstellung des Manuskripts.

Medizinische Fakultät der University of Southampton, Southampton, SO16 6YD, Vereinigtes Königreich

Jana Kralovicova, Marcin Knut, Nicholas CP Cross und Igor Vorechovsky

Wessex Regional Genetics Laboratory Salisbury Hospital, Salisbury, SP2 8BJ, Vereinigtes Königreich

Nicholas CP Cross

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JK und IV haben die Experimente entworfen und durchgeführt. JK, MK und IV führten bioinformatische und statistische Analysen experimenteller und RNA-Seq-Daten durch. NCPC steuerte Leukämieproben bei und JK, MK, NCPC und IV verfassten das Manuskript.

Ein Teil dieser Arbeit unterliegt einer britischen Patentanmeldung. Die Autoren geben keine weiteren konkurrierenden finanziellen Interessen an.

Dieses Werk ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe nichts anderes angegeben ist; Wenn das Material nicht unter der Creative-Commons-Lizenz enthalten ist, müssen Benutzer die Erlaubnis des Lizenzinhabers einholen, um das Material zu reproduzieren. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/

Nachdrucke und Genehmigungen

Kralovicova, J., Knut, M., Cross, N. et al. Die exonzentrische Regulierung der ATM-Expression ist bevölkerungsabhängig und kann durch Pseudoexon-Targeting antisense-modifiziert werden. Sci Rep 6, 18741 (2016). https://doi.org/10.1038/srep18741

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Eingegangen: 6. September 2015

Angenommen: 25. November 2015

Veröffentlicht: 06. Januar 2016

DOI: https://doi.org/10.1038/srep18741

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